苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的EA.hy926细胞Bcl-2表达的影响

柳 春 杨雪峰 张瑞鹏 赵丹玉 王艳杰

(辽宁中医药大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳 110032)

血管并发症是致2型糖尿病患者死亡的主要原因，而高频率的内皮细胞凋亡是血管病变发生的第一步〔1〕。苦荞麦总黄酮主要存在于苦荞麦花、叶、茎、籽粒中，具有抗氧化、抗衰老、改善血管微循环的作用〔2〕。软脂酸(PA)可致内皮细胞凋亡。本实验通过观察苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)凋亡模型的影响，探讨其抑制细胞凋亡的保护机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人脐静脉内皮细胞EA.hy926购自中国科学院上海细胞库，体外培养传代。DMEM/HIGH GLUCOSE培养基、胎牛血清购自HyClone公司；PA、二甲基亚砜购自Sigma公司、0.25%胰蛋白酶购自北京鼎国公司；RT-PCR 试剂盒、Trizol、琼脂糖购自TaKaRa公司。兔抗人Bcl-2抗体、羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组 细胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基置于37℃，5% 二氧化碳(CO2)孵箱中培养,每2～3天换液，细胞长至亚融合后,用0.25%胰酶消化传代，实验用第3～4代细胞。细胞分为对照组(50 ng/L胰岛素),模型组(50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA)，苦荞麦总黄酮组(50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA+125 μg/ml)和二甲双胍组 (50 ng/L胰岛素+600 mmol/L PA+2 mmol/L二甲双胍) 。

1.2.2RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA表达 Trizol法提取总RNA并测定其含量。RT-PCR法对Bcl-2进行扩增，以β-actin 为内参。人β-actin 引物:上游引物：AggAgC AATgATCTTgATCTTCA-3′，下游引物:5′-ATCATgAAgTgTACgTggACAT-3′(扩增长度153 bp)。Bcl-2引物：上游引物：5′-TgggAgAACAgggTACgATA-3′，下游引物： 5′-CCACCgAACTCAAAgAAgg-3′(扩增长度453 bp)。Bcl-2 退火温度为56℃，β-actin 的退火温度为65℃。取扩增产物5 μl,用1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶图像分析系统进行对电泳结果进行分析，结果用Bcl-2 条带光密度值与内参β-actin条带光密度值的比值表示。

1.2.3免疫组织化学法检测Bcl-2 蛋白表达 采用免疫组化SABC法测定EA.hy926细胞Bcl-2 蛋白的表达。各组细胞处理后用多聚甲醛固定,PBS冲洗3遍，加0.5%的TritonX100 20 min,再次用PBS冲洗3遍，加0.3% 过氧化氢(H2O2)15 min。5%BSA封闭20 min，滴加兔抗人Bcl-2 抗体4℃过夜。用HRP标记的羊抗兔IgG 37℃ 20 min。PBS冲洗3遍，DAB法显色。阴性对照：一抗用PBS代替，其余条件相同。

2 结 果

2.1苦荞麦总黄酮对PA刺激后EA.hy926 细胞Bcl-2 mRNA 表达的影响 模型组中Bcl-2 mRNA 表达水平明显降低,与对照组有显著差异(P<0.01)；与模型组相比，苦荞麦总黄酮组与苦荞麦总黄酮组Bcl-2 mRNA 表达显著增加(P<0.05)。苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2苦荞麦总黄酮对PA刺激后EA.hy926 免疫组化结果表明，对照组可见大量Bcl-2阳性表达细胞,且呈强阳性表达；模型组偶见Bcl-2 阳性表达细胞,阳性程度较弱；苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组可见大量Bcl-2 阳性表达细胞，阳性程度与模型组相比显著增加。见表1。

表1 苦荞麦总黄酮对PA刺激后EA.hy926细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响±s,n=6)

3 讨 论

血浆游离脂肪酸(FFA)浓度增高是糖尿病血管病变的重要危险因素，而PA是FFA 的主要成分。已证实，高浓度PA 可导致胰岛素抵抗，导致2型糖尿病的发生，并诱导内皮细胞凋亡〔3，4〕。细胞凋亡是为维持内环境稳定，细胞主动的、由基因调控的死亡过程〔5〕。Bcl-2 家族在内皮细胞凋亡的过程中起着至关重要的作用。此家族包括两类功能相反的蛋白,促凋亡成员如Bax、Bad 等，抗凋亡成员如Bcl-2、Bcl-xl 等。Bcl-2 是一种原癌基因，通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。所以，Bcl-2 表达下调,则抗凋亡能力下降,细胞凋亡增加〔6〕。而内皮细胞过度凋亡则促使血栓形成〔7〕，影响血管重构，从而诱发糖尿病血管病变。因此,抑制血管内皮细胞的过度凋亡是防治糖尿病血管并发症的关键。但目前临床尚缺乏有效药物。

苦荞麦味苦，性平、寒，有悠久的入药历史。《本草纲目》：“降气宽肠磨积滞 ，消热肿风痛。”流行病学研究结果表明：苦荞麦具有降血糖、降血脂和降血压的作用〔8〕。苦荞麦总黄酮是苦荞麦主要化学成分，具有软化血管、降低毛细血管脆性、改善微循环、防止血细胞凝集等作用〔9〕，主要包括芦丁、槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-双鼠李糖苷等〔10〕。本实验旨在观察苦荞麦总黄酮对PA诱导的内皮细胞凋亡的影响。研究发现苦荞麦总黄酮可明显改善内皮细胞功能障碍，抑制PA所诱导的血管内皮细胞凋亡。本实验以RT-PCR 技术和免疫组化法检测各组细胞Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平，结果表明，同对照组相比，模型组细胞Bcl-2 基因和蛋白表达水平显著降低，说明PA可降低Bcl-2 基因的表达，从而促进内皮细胞凋亡；苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组细胞同模型组相比，EA.hy926 细胞Bcl-2 mRNA及蛋白明显升高，说明苦荞麦总黄酮及二甲双胍可促进Bcl-2 mRNA和蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡,提升EA.hy926细胞的增殖能力。苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组相比，Bcl-2基因及蛋白的表达无明显差异，作用相当。但是二甲双胍毒副作用较强，不适于长期使用。

本研究证实，苦荞麦总黄酮能促进Bcl-2 基因的表达，抑制内皮细胞凋亡。因此，苦荞麦总黄酮有利于血管内皮的修复及新生血管的形成，对2型糖尿病血管并发症的防治有十分重要的意义。

4 参考文献

1Vanhoutte PM，Shimokawa H，Tang EH,etal.Endothelial dysfunction and vascular disease〔J〕.Acta Physiologica,2009；196 (2):193-222.

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3张文杰,史英钦,宋光耀,等.不同的脂肪酸对人血管内皮细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志,2005；25(7):1312-4.

4高 宇,宋光耀.骨骼肌脂肪酸代谢与胰岛素抵抗〔J〕.中国老年学杂志,2009；29(3):378-80.

5Bonavita F，Stefanelli C，Giordano E,etal.H9c2 cardiac myoblasts undergo apoptosis in a model of ischemia consisting of serum deprivation and hypoxia：inhibition by PMA〔J〕.FEBS Letters，2003；536(123):85-91.

6Mrino D，Bouillet P.The Bcl-2 family in autoimmune and degenerative disorders〔J〕.Apoptosis，2009；14(4):570-83.

7Bombeli T，Karsan A，Tait JF，etal.Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulant〔J〕.Blood,1997；89(7):2429-42.

8张宏伟,张永红,卢明俊,等.食用荞麦对血糖、血脂及血压的影响〔J〕.环境与职业医学,2003；20(2):120-4.

9田秀红,刘鑫峰,闫 峰,等.苦荞麦的药理作用与食疗〔J〕.农产品加工,2008；(8):31-3.

10朱 瑞,卞庆亚,林宏英,等.苦荞麦种子化学成分研究〔J〕.中医药信息，2003；20(3)：17-8.