不同压力高压氧对实验性脑出血大鼠模型血肿周围水肿及MMP-9和TIMP-1表达的影响

李中华 张 贺 刘 冰 李国辉 房绍伟

(潍坊医学院外科教研室，山东 潍坊 261053)

研究认为发生脑出血后，在血肿周围通常会形成组织损伤及水肿进行性加重区域。同时，脑出血症状发生后，患者神经功能恶化与血肿周围组织产生的继发性损伤有一定联系〔1〕。对于凝血酶和基质金属蛋白酶(MMP)-9在脑出血之后的相关作用已被公认。然而，但对于MMP抑制剂(TIMP)-1的联合研究较少〔2〕。目前在临床上应用高压氧预防脑出血水肿已有一定进展，但对于压力的选择有所争议。本文采用不同压力高压氧治疗实验性脑出血大鼠，研究其对血肿周围水肿情况以及血肿周围MMP-9及TIMP-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物 选取我院实验中心SPF级成年健康SD大鼠90只，均为雄性。体重300～355 g，平均(325.7±3.6)g。采用标准化分笼饲养。建模后以数字法随机分成对照组18例(ICH组，常规脑出血模型，不进行处理)；常压氧组18例(ICH 1.0 ATA组)；高压氧组54例，依照不同压力分为：ICH 1.8 ATA组、ICH 2.0 ATA组、ICH 2.2 ATA组各18例。各组分别在治疗后1、3、5 d行断头取脑处理，每时间点6只。在制模成功之后24 h依照不同的压力治疗1次/d，常压氧组及高压氧组在治疗压力上有区别外，另同时予以吸入浓度90%的氧气。

1.2模型制备 通过胶原酶Ⅶ(购自上海基免实业有限公司)注射诱发尾壳核脑的出血模型。对大鼠进行称重后，以10%的水合氯醛(剂量为0.4 ml/100 g)行腹腔内注射，确保手术时大鼠可自主呼吸，将其俯卧固定在立体定位仪，并使其前后囟处在同一水平。常规备皮和消毒，在颅正中处行矢状切口1.5 cm，以盐水棉球轻擦，暴露前囟，在前囟后约1 mm，矢状线的右侧3 mm经尖头改锥在颅骨上钻孔，直径大约1 mm，深达骨膜。在立体定位仪上垂直固定含0.6 U的胶原酶Ⅶ以及3 μl生理盐水的微量注射器。确保针头和小孔处于同一直线，进针大约6 mm，匀速推注约5 min，并留针10 min。再缓慢出针5 min，总计20 min。最后以骨蜡将颅孔封闭，缝合、消毒，放置空笼内至大鼠苏醒。

1.3制模成功的判定〔3〕模型制备24 h后仔细观察大鼠的行为学变化。依照Longa评分法评定，0分：无体征；1分：无法完全伸展对侧肢体(即左侧)；2分：对侧肢体已瘫痪，且向对侧转圈，可发生追尾；3分：无法站立且倒向对侧；4分：意识障碍。2分以上即可判定为造模成功。

1.4加压方法 大鼠在造模成功之后即可进舱治疗，将其放置于特制木箱(上盖是玻璃)内，箱底有供氧管进口，而对角箱底亦设置出气口。木箱放置舱中，压力依照分组设定，分别加压约30 min，在压力达到稳压前的5 min予以直排式供氧，流量设定为10 L/min，开始供氧，使其稳压吸入60 min后终止供氧。可开始匀速增减压速率设定为0.01 mPa/min，减压时间为30 min，1次/d。经观察窗对舱内大鼠行为进行观察记录，常压氧不加压，对照组不进行相应治疗，其余步骤均同上。

1.5周围水肿组织的含水量测定 以干湿比重法进行测定。先去除额极，取出病变侧约2 mm的脑组织，并将脑组织放于已称重的锡纸A内，之后立刻称重，所得重量以B表示，B-A为脑组织的湿重。再将脑组织以锡纸包裹，置于烤箱中以120℃烘干8 h后取出。恢复至室温称重，记为C，C-A为干重。含水量=(B-C)/(B-A)×100%。

1.6MMP-9及TIMP-1水平测定 均以免疫组化法检测，采用MMP-9、TIMP-1单克隆抗体以及免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥公司)。严格按说明书操作。

2 结 果

2.1各组不同时间脑组织的含水量对比 各组大鼠脑组织的含水量在出血后第3天达到峰值，而后下降。ICH组与ICH 1.0 ATA组在各时间点对比，含水量差异均无统计学意义(P>0.05)。第1天时ICH 2.0 ATA组的脑组织水含量显著少于ICH组和ICH 1.0 ATA组。第3天与第5天时，ICH 1.8 ATA组、ICH 2.0 ATA组和ICH 2.2 ATA组均显著少于ICH组和ICH 1.0 ATA组；而ICH 2.0 ATA组在第3天和第5天时的脑组织水含量少于ICH 1.8 ATA组以及ICH 2.2 ATA组(均P<0.05)。见表1。

2.2各组血肿周围MMP-9及TIMP-1表达水平对比 ICH组与ICH 1.0 ATA组，以及ICH 1.8 ATA组与ICH 2.2 ATA组在第1、3、5天等比较MMP-9及TIMP-1水平差异均无统计学意义(P>0.05)。但第1、3、5天时ICH 2.0 ATA组的MMP-9水平均分别显著低于ICH组、ICH 1.0 ATA组、ICH 1.8ATA组和ICH 2.2 ATA组。第1、3天时ICH 2.0 ATA组的TIMP-1水平均显著高于ICH组、ICH 1.0 ATA组、ICH 1.8 ATA组和ICH 2.2 ATA组(均P<0.05)。见表2。

表1 各组不同时间脑组织含水量对比(%，±s，n=6)

表2 各组血肿周围MMP-9及TIMP-1表达水平对比±s,个/H，n=6)

3 讨 论

脑水肿作为脑出血发生后最主要的一种继发型病理变化，其严重程度对患者的预后可产生极大的影响〔4〕。因此，对脑水肿实施有效治疗可缓解患者脑继发型损害，从而更好地保护及促进其神经功能的恢复。

本研究结果显示，相对于其他各组，ICH 2.0 ATA组的治疗效果更佳，此压力参数可能为临床所需。究其原因，笔者认为可能和以下几点有关：(1)高压氧治疗通过提升氧在脑组织中的有关弥散距离，增加血氧分压，利于侧支循环的建立及降低脑血流量和颅内压等诸多途径使脑水肿组织氧供和血流灌注明显改善〔5〕。还可阻断发生脑出血之后的“缺氧-水肿-缺氧”这一恶性循环，最终有效减少出血灶四周的脑组织水含量〔6〕。同时，高压氧还可提升有氧代谢，缓解组织酸中毒，对脑内环境亦有改善作用，降低脑内血管通透性，从而减轻水肿症状〔7〕。(2)在高压氧环境下，脑血流量的氧压为2.0 ATA时，其随动脉氧分压水平的上升逐渐下降，而若氧压>2.0 ATA，脑血流量水平又会趋于增加。本次研究的1.8 ATA组压力虽然相对较低，但并未获得最佳疗效，这亦提示氧分压在选取时不能过低。而2.2 ATA组的压力更高，效果却仍然不佳，这可能是由于过高压力抑制了脑对糖类的摄取、影响脑内糖代谢，增大了脑血流量从而诱发脑出血〔8〕。有报道证实〔9〕，脑血肿清除的患者若处于>2.0 ATA的压力治疗下，容易发生头痛加剧、术中减压窗张力上升以及脑组织膨出显著等症状；若压力降为2.0 ATA时，上述情况逐渐好转。因此，笔者认为，对脑出血合并脑水肿者，压力治疗应以2.0 ATA为分界线。(3)在MMP-9及TIMP-1水平方面，二者产生上述变化的原因可能是ICH后，常规通过酶原-抑制剂的复合物形式共存的MMP-9和TIMP-1等物质发生解离，TIMP-1伴随MMP-9的表达水平上升而升高，但表达程度明显低于MMP-9，打破了二者间存在的动态平衡，经生化作用导致血管源性脑水肿〔10〕。在高压氧治疗后，不同压力产生的影响效果不一，但以压力为2.0 ATA的效果最佳，MMP-9水平整体下降，上调了TIMP-1水平，调整了MMP-9及TIMP-1的动态平衡，进而缓解微血管基底膜的胶原降解从而发挥保护血脑屏障的效果，最终缓解了神经损伤。Yang等〔11〕亦通过研究证实了高压氧治疗血肿后脑水肿下调周围组织的MMP-9及上调TIMP-1的表达。

综上所述，不同压力的高压氧对血肿周围水肿症状具有一定的治疗作用，但压力治疗应以2.0 ATA为分界线。

4 参考文献

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5唐晓平，张 涛，彭 华.高压氧对重型颅脑损伤患者外周血白细胞和继发性脑损害的影响〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2011；5(4)：1002-6.

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8Yaman O，Yaman B,Aydin F,etal.Hyperbaric oxygen treatment in the experimental spinal cord injury model〔J〕.Spine J，2014；30(14)：162-4.

9施振华，徐宏治，丁建波，等.高压氧预处理减轻大鼠脑出血后脑水肿〔J〕.中华急诊医学杂志，2010；19(6)：610-4.

10王同新，赵竹玲，王善军，等.脑出血大鼠脑水肿与血肿周围组织MMP-2、MMP-9表达的相关性〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(4)：885-6.

11Yang J，Wang G，Gao C，etal.Effects of hyperbaric oxygen on MMP-2 and MMP-9 expressions and spinal cord edema after spinal cord injury〔J〕.Life Sci，2013；93(25-6)：1033-8.