ApoAI对原代培养人Müller细胞生长的影响

张红花，刘瑶

(苏州大学附属第三医院 眼科，江苏 常州 213000)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的最主要并发症之一，是严重致盲性眼病；视网膜Müller细胞是DR的主要参与细胞。而ApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白，其在胆固醇逆向转运、抑制低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰、前列环素的稳定、保护血管内皮细胞以及稳定细胞膜结构中发挥重要作用[1]。最近研究表明，ApoAI是主要的抗粥样硬化因子[2]。国内已有报道中国糖尿病人群ApoAI显著低于健康人群[3]，而apoB与ApoAI的比值显著高于健康人群[4]，作者拟研究ApoAI对Müller细胞增殖与凋亡的影响，以期探讨视网膜Müller细胞参与DR的始动因素。

1 材料与方法

1.1 人视网膜Müller细胞的原代培养

按朱茂丽等[5]报道的方法稍加改进进行细胞培养：取角膜移植后的眼杯(取自于苏州大学第三临床医学院眼科)，自锯齿缘后1～2mm处环形剖开眼球，去除眼前部组织及玻璃体，留后半眼球壁于DMEM培养液中，轻轻剥取视网膜组织，将视网膜组织放于含DMEM培养基的一次性塑料培养皿中，在解剖显微镜下将视网膜组织剪成约1mm×1mm大小的组织块制成组织块悬液，离心弃上清，加入5倍组织块体积的0.25%的胰酶悬浮组织块，细胞培养箱放置5min后取出加入等体积的20%FBS的DMEM培养液后用移液器轻轻吹打10次，离心弃上清，加入20%FBS的DMEM培养液再次制成组织块悬液接种于培养瓶中，置于恒温恒湿培养箱(37℃，体积分数为5CO2)中培养，开始1周不换液，若培养液变黄则小心用移液器吸出部分培养液后加入新鲜培养液，待1周后细胞爬出后换液，见80%以上的细胞融合以后传代培养。经免疫组化鉴定培养出的细胞为视网膜Müller细胞。

1.2 实验分组与实验方法

以P3代对数生长期的人视网膜Müller细胞用于实验，当Müller细胞达80%以上融合状态时予以0.25%胰蛋白酶消化，用含20%FBS的DMEM培养液制成细胞悬液接种至6孔培养板中，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%%CO2培养箱中孵育。24h后取出6孔培养板，小心吸弃原培养液，用无FBS的DMEM培养液漂洗两次，不同ApoAI浓度组中分别加入浓度为0、0.01、0.1、1μg·ml-1的DMEM培养液3ml，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%%CO2培养箱中继续孵育24h。

倒置显微镜下观察各组Müller细胞形态。流式细胞术检测Müller细胞的细胞周期，0.25%胰酶消化6孔板中的细胞制成单细胞悬液并收集到流式管中， PBS洗两次以除去其中的培养液和胰酶等物质，然后使用美国BD公司的DNA异倍体染色试剂盒，按照说明书依次加入A、B、C 3种试剂后上机检测。流式细胞术检测Müller细胞的凋亡，0.25%胰酶消化六孔板中的细胞制成单细胞悬液并收集到流式管中， PBS洗两次以除去其中的培养液和胰酶等物质，将细胞悬液离心弃上清后加入 195μl Annexin V- FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μl Annexin V- FITC轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育10min。1000g离心5min，弃上清，加入190μl Annexin V- FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10μl碘化丙啶染色液轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测。荧光显微镜下观察凋亡细胞形态，按上述步骤处理细胞最后一步不进行流式细胞仪检测，而是离心收集细胞后用50～100μl Annexin V- FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后于荧光显微镜下观察。

1.3 统计学处理

实验数据均以均数±标准差表示，应用SPSS统计软件进行单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同药物浓度组Müller细胞形态

各组Müller细胞呈典型的多角形，大小均匀、边界清晰、形态无明显差异。见图1。

A、B、C、D.分别是0、0.01、0.1、1μg·ml-1浓度组的细胞形态

图1不同药物浓度组培养1d后的细胞形态

2.2 不同药物浓度组人视网膜Müller细胞的细胞周期分布

采用单因素方差分析的统计方法，药物处理后G1期细胞百分比无明显变化(F=0.432,P>0.05)，S期细胞百分比明显增多(F=11.007，P<0.05)，G2期细胞百分比明显降低(F=20.350，P<0.05)。见表1。

表1 各组人视网膜Müller细胞的细胞周期分布 %

2.3 Annexin V- FITC/PI细胞凋亡的检测结果

0、0.01、0.1、1μg·ml-14个不同浓度组别人视网膜Müller细胞的凋亡数目百分比分别为(10.19±3.49)%、(12.90±2.35)%、(9.86±0.50)%、 (13.91±4.83)%，采用单因素方差分析的统计方法，药物处理后细胞凋亡百分比差异无统计学意义(F=1.166，P=0.381)

2.4 荧光显微镜下晚期凋亡和早期凋亡细胞的形态

荧光显微镜下4组凋亡细胞的数目及形态未见明显差异,见图2。

3 讨 论

DR是糖尿病最常见而严重的并发症之一，近几年国内外学者研究认为，Müller细胞在视网膜血管病变之前其形态结构和生理功能就发生了变化，Müller细胞的这些变化在DR的发生发展中起重要作用[6]。Müller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞，该细胞从视网膜的内界膜延长至外界膜，贯穿于视网膜感觉神经全层，发挥着稳定视网膜的复杂结构、提供定向支架、从结构和功能上支持视网膜神经元和血管、阻止异常光感受器细胞迁移入视网膜下间隙的功能[7]。因此，探讨微环境内外因素对视网膜Müller细胞的影响有利于我们认识该细胞在DR过程中的作用。

A.晚期凋亡细胞的细胞核显示红色荧光;B.早期凋亡细胞的细胞膜显示绿色荧光

图2荧光显微镜下凋亡细胞的形态

ApoAI主要是由小肠和肝脏合成的一种载脂蛋白，其主要分布在血浆乳糜颗粒(CM)、HDL2、HDL3中。成熟的人ApoAI由243个氨基酸组成，相对分子质量为28 300。ApoAI在胆固醇逆向转运、抑制LDL的氧化修饰、前列环素的稳定、保护血管内皮细胞以及稳定细胞膜结构中发挥重要作用[8]。国内已有报道中国糖尿病人群ApoAI显著低于健康人群，而apoB与ApoAI的比值显著高于健康人群[9]。

本实验中，加入ApoAI后处于S期的细胞比例明显增加，而相应的G2期细胞明显减少，并且随着ApoAI浓度的增加这种趋势更加明显。说明ApoAI可以抑制Müller细胞的增殖，使细胞增殖过程阻滞在S期和G2期之间。因此，ApoAI可能是通过阻滞细胞的分裂来抑制细胞的增殖。

在本次细胞凋亡实验中，加入ApoAI的流式结果显示细胞凋亡比例没有明显变化，说明ApoAI对Müller细胞的凋亡无明显作用，也表明ApoAI对Müller细胞的作用应该是通过其它路径，即可能通过阻滞细胞的分裂来抑制细胞的增殖。

综上所述，ApoAI可以抑制人视网膜Müller细胞的增殖，且这种抑制作用随着ApoAI浓度的增加而增强；ApoAI对细胞凋亡无明显作用。由此我们可以推断，糖尿病状态下由于ApoAI的显著降低以及apoB与ApoAI的比值显著增高，可能解除了对于视网膜Müller细胞抑制作用，从而促进了DR的发生。

[1] SAITO H,DHANASEKARAN P,NGUYEN D,et al.Alpha- helix formation is required for high affinity binding of human apolipoprotein A- I to lipids[J].The Journal of Biological Chemistry,2004，279(20):20974- 20981.

[2] 张扬，冉建民，徐刚.2型糖尿病患者高密度脂蛋白水平变化分析[J].中国基层医药,2007,14(7):1196- 1197.

[3] 王慧，王晓琴.糖尿病合并急性脑梗死老年患者的血脂分析[J].实用医学杂志,2011,28(3):193- 195.

[4] AYYOBI A F,BRUNZELL J D.Lipoprotein distribution in the metabolic syndrome,type 2 diabetes mellitus,and familial combined hyperlipidemia[J].The American Journal of Cardiology,2003,92(4A):27J- 33J.

[5] 朱茂丽,刘瑶,陈平圣,等.糖基化终产物对视网膜Mailer细胞表达血管内皮生长因子的影响[J].中国糖尿病杂志,2008,16(11):691- 693.

[6] GUIDRY C,KING J L,MASON J O.Fibrocontractive Muller cell phenotypes in proliferative diabetic retinopathy[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2009,50(4):1929- 1939.

[7] NEWMAN E,REICHENBACH A.The Muller cell:a functional element of the retina[J].Trends in Neurosciences,1996,19(8):307- 312.

[8] 杨开燕,钟栩,卢玉俊.血浆载脂蛋白的研究进展[J].临床荟萃,2012,27(14):1268- 1271.

[9] 何爱琴,吴小梅,缪珩.2型糖尿病患者ApoAl/ApoB之值与其血管并发症关系分析[J].现代医学,2012,40(5):556- 559.