人参皂甙对氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆功能的影响

邓 昌 欧阳波 陶 然 余顺治 金 华

(昆明市官渡区人民医院急诊科，云南 昆明 650200)

术后认知功能障碍(POCD)可导致患者丧失独立生活的能力，给家庭和社会造成严重的负担。氯胺酮为N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的非竞争性拮抗剂，是一种临床上常用的静脉麻醉药。研究发现，氯胺酮能损害大脑的神经细胞，引发POCD的产生〔1，2〕。目前还没有一个公认的治疗或预防POCD的方法。人参是我国传统的中药，其主要活性成分人参皂甙对老龄动物的神经系统具有良好的改善及保护作用。人参皂苷的成分如人参皂甙Rg1和Rb1能促进胆碱能代谢，改善中枢胆碱能系统，增强动物的学习和记忆能力〔3〕。人参皂甙还能通过增加大脑神经营养因子的表达，发挥神经保护作用。研究发现，人参皂甙对电休克、脑缺血和睡眠剥夺等造成的动物学习记忆功能受损均有显著性地保护作用〔4～6〕。然而，人参皂甙对麻醉术后学习和记忆障碍的影响，目前报道较少。本实验将通过Morris水迷宫实验，探讨人参皂甙对氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆的影响及其可能的机制，为临床防治POCD提供理论依据与参考。

1 资料与方法

1.1实验动物 14月龄的清洁级健康SD大鼠48只，体重400～450 g,由昆明医学院实验动物中心提供。大鼠在实验前适应性驯养1 w，自由摄食饮水。

1.2实验药品及仪器 盐酸氯胺酮注射液(购自福建古田药业有限公司，批号：110301-2)；人参皂苷(购自吉林省集安万泰中药厂)；Morris水迷宫仪(由北京普升科技有限公司提供)；神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)检测试剂盒(Rapidbio公司进口分装)。

1.3动物分组及处理 随机分为四组，每组12只：对照组(A组)、氯胺酮组(B组)、人参皂甙低剂量组(C组)和人参皂甙高剂量组(D组)。A组：第1天(D0)腹腔注射生理盐水，第2天(D1)至第6天(D5)无药物处理。B组：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，从第2天(D1)开始每日腹腔注射生理盐水，持续至D5。C组：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，从第2天(D1)开始每日腹腔注射人参皂甙(20 mg/kg)，持续至D5。D组：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，从第2天(D1)开始每日腹腔注射人参皂甙(100 mg/kg)，持续至D5。

1.4水迷宫实验 Morris水迷宫由一个直径130 cm、高50 cm的圆形水池及一个直径为12 cm的圆柱形玻璃平台构成。池壁分为4个象限，标有4个入水点。实验前水池注入水至水平面高于平台顶1 cm。实验过程中保持环境的安静，水温控制在(23±2)℃。实验过程参照参考文献进行，分为两部分：(1)定位航向实验，D0于麻醉前让大鼠自由游泳2 min，熟悉迷宫环境。从D1起，每天注射药物2 h后，对大鼠进行4次训练，每次训练间隔60 s。从4个不同入水点将大鼠面向池壁分别放入水中，记录大鼠爬上平台所需的时间(即逃避潜伏期)，找到平台后，让大鼠停留于平台上10 s。如果在2 min内大鼠未找到平台，则人为地将其引至平台上停留10 s，此时潜伏期记为120 s。(2)空间探索实验：在D5最后一次训练后，撤除平台，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，测量大鼠在120 s内跨过原平台位置的次数。

1.5海马区神经营养因子的检测 Morris水迷宫实验结束后，断头开颅取脑，将海马组织用4℃生理盐水迅速制成1∶9匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液,用于NGF和BDNF含量的检测。NGF和BDNF的检测采用ELISA法。操作过程严格按照试剂盒说明书的要求进行。

1.6海马区p-ERK和p-CREB表达水平的检测 Morris水迷宫实验结束后，断头开颅取脑，分离海马组织，放入玻璃研磨器中磨碎为分散的细胞。加入0.5 ml的细胞裂解液(0.1 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L Tris-HCl pH 7.6，1 mmol/L EDTA pH 8.0，1 μg/ml Aprotinin，100 μg/ml PMSF)冰上裂解45 min,15 000 r/min离心15 min,取上清液，-80℃保存，用蛋白免疫印记法检测p-ERK和p-CREB的表达水平。具体过程如下：BCA法行蛋白定量分析。根据目的蛋白的分子量，配制12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离后，将蛋白质电转至PVDF膜中。用15 ml含有5%牛血清白蛋白的TTBS缓冲溶液4℃封闭过夜。然后分别加入ERK (1∶1 000)、 p-ERK(1∶500)、CREB (1∶1 000)和p-Ser133-CREB(1∶500)的一抗封闭1 h。TTBS洗膜3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶偶联的IgG抗体，于室温轻摇1 h杂交反应，TTBS洗膜6次，每次5 min。加入化学发光底物反应5 min后保鲜膜包裹，暗室内进行X线胶片曝光、显影和定影。

2 结 果

2.1定位航向实验结果 经过5 d的隐匿平台训练，各组逃避潜伏期呈逐渐缩短的趋势。D1和D2时各组间均无显著差异；D3～D5，与A组相比，B组寻找平台的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与B组相比，C组的逃避潜伏期于D4时缩短明显，而D组的逃避潜伏期于D3时已开始显著缩短。见表1。

2.2空间探索实验结果 氯胺酮麻醉后各组大鼠穿越原平台位置的次数与A组(6.8±0.5)相比均有所减少，其中B组(3.8±0.4)差异显著(P<0.05)。C组(4.2±0.6)和D组(5.9±0.5)大鼠穿越原平台位置的次数均明显比B组增加(P<0.05)。

2.3各组大鼠海马区神经营养因子表达水平的变化 与A组相比，B组大鼠海马匀浆中NGF和BDNF的含量下降(P<0.01)；与B组比较，C组和D组NGF和BDNF的含量均明显增加(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点逃避潜伏期的变化

表2 各组大鼠海马区NGF和BDNF的表达变化

2.4各组大鼠海马CREB、p-Ser133-CREB的表达变化 蛋白免疫印迹结果显示，与A组相比，B组大鼠海马总CERB蛋白表达无显著性差异，B组海马p-Ser133-CREB的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与B组比较，C组和D组海马p-Ser133-CREB的蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)。见图1。

2.5各组大鼠海马ERK、p-ERK的表达变化 蛋白免疫印迹结果显示，与A组相比，B组大鼠海马总ERK蛋白表达无显著性差异，B组海马p-ERK的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与B组比较，C组和D组海马p-ERK的蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)。见图2。

图1 人参皂甙对海马区CREB活性的影响

图2 人参皂甙对海马区ERK活性的影响

3 讨 论

神经营养因子是一类对神经组织起着特殊营养作用的小分子多肽因子，在中枢神经系统的发育过程中能够促进神经细胞的增殖、生长、分化和存活，并可调节突触的可塑性，其中以NGF和BDNF最为重要。NGF通过与特异性的TrkA受体结合，激活细胞代谢，促进神经细胞的增殖和分化，调节中枢和周围神经细胞的存活和轴突的生长， 并对神经细胞损伤的修复起着十分重要的作用。而BDNF通过与其特异性的高亲和力受体TrkB结合而发挥神经营养作用。随着研究的深入，研究发现神经营养因子在改善认知功能方面具有十分重要的作用〔7，8〕。NGF和BDNF可以改善老年痴呆模型鼠的学习记忆能力，促进神经元的生长〔9〕。研究证实，氯胺酮会导致认知功能障碍〔10〕。本研究显示氯胺酮所致的认知功能障碍与其引起的神经营养因子减少有关。人参皂甙可通过增加NGF和BDNF的水平改善氯胺酮所致的学习记忆障碍：①在成熟的神经系统中，NGF和BDNF具有维持神经细胞生存的作用；而在神经系统损伤的情况下其具有神经保护与修复的功能。研究发现，氯胺酮可导致神经细胞的凋亡〔11～13〕。因此，人参皂甙可能通过维持NGF和BDNF表达水平，以维持神经细胞的存活，抑制细胞凋亡，从而改善氯胺酮所致的学习记忆障碍。②乙酰胆碱是中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与注意力、记忆和睡眠等过程〔14，15〕。拟胆碱能药物或海马区内移植胆碱能胚胎组织均可改善学习记忆功能。NGF的缺失会导致胆碱能神经元发生皱缩，减少胆碱能神经元的纤维密度，降低乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱的含量〔16〕。NGF和BDNF表达水平的增加能够促进神经递质如乙酰胆碱的合成，并对胆碱能神经元起营养作用，改善动物的学习记忆能力。本实验研究发现，人参皂甙可以阻止氯胺酮所致NGF和BDNF表达水平的减少。因此，人参皂甙可能通过维持NGF和BDNF表达水平，以维持胆碱能神经元的活性，并增加乙酰胆碱的含量，从而改善氯胺酮所致的学习记忆障碍。

cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是一种重要的核转录因子，具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能〔17〕。当CREB的第133位丝氨酸发生磷酸化时，磷酸化的CREB即成为活性状态，从而调节启动子中具有cAMP应答元件的基因转录。在中枢神经系统中，CREB参与突触可塑性和长时程记忆的形成过程。CREB表达量或活性的下降会导致学习记忆障碍，而CREB的高表达可改善学习记忆功能。研究发现，许多与学习记忆相关的基因都受到CREB的调控，如神经递质受体亚基GluR1、BDNF和即早基因等。CREB的活性受到多条信号转导通路的调节，如cAMP-PKA通路、有丝分裂原激活的蛋白激酶通路、钙离子-钙调蛋白激酶通路和应激相关的P38通路。已有研究发现，氯胺酮所致的学习记忆障碍与其对ERK和CREB活性的抑制有关〔18，19〕。而本实验研究发现，氯胺酮可降低老年大鼠海马区内p-ERK和p-CREB的表达水平；而人参皂甙可以阻止氯胺酮对p-ERK和p-CREB的抑制作用。因此，人参皂甙可能通过增加NGF和BDNF表达水平，激活ERK-CREB信号通路，以增加学习记忆相关基因(如NGF、BDNF、c-fos等)的表达，从而改善氯胺酮所致的学习记忆障碍。

人参皂甙是人参的主要活性成分，具有多种生物学活性，如抗氧化作用、抗凋亡作用、抗兴奋性毒害和钙通道拮抗作用等。近年研究发现，人参皂甙还具有神经营养和神经保护作用，能够增强学习记忆，抵抗衰老。学习和记忆是一个十分复杂的神经活动过程，需要神经递质、信号分子、神经营养因子和基因表达的协同作用。人参皂甙能增加基底前脑乙酰胆碱转移酶及海马区内NGF和BDNF的表达〔20，21〕。在NGF缺失下，人参皂甙可以促进PC12细胞轴突的生长〔22〕。本实验结果发现，人参皂甙对氯胺酮麻醉后老年大鼠学习记忆功能的改善作用，与其恢复氯胺酮导致海马区NGF和BDNF的低表达及p-ERK和p-CREB的低活性有关。然而，人参皂甙是否还可以通过其他途径(如抗氧化和抗凋亡等)改善氯胺酮所致的学习记忆障碍，其机制如何，还有待进一步研究。综上所述，人参皂甙可用于POCD的防治。

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