滋肾益脑方对肾阴虚抑郁模型大鼠脑源性神经营养因子、酪氨酸激酶受体B基因表达的影响

秦莉花 李 晟 陈晓阳 秦莉峰 方 晗 吴艳飞 黄 宽

(湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208)

抑郁症(DEP)以显著持续性心境低落为主要特征，同时也存在认知功能改变和其他精神症状、食欲、睡眠障碍以及自主神经功能紊乱、特发性疼痛等伴发症状。世界卫生组织研究显示，在全球神经精神疾病的负担中，预测到2020年DEP将成为仅次于冠心病的第2位疾病负担源〔1〕。因此，应该加强对DEP的防治意义重大。由于长期的情志不畅损伤肝肾，耗伤阴精致骨髓失充、髓海失养，脑神不得伸展而成郁，故肝肾阴虚导致的DEP甚为常见，尤多见于疾病中、后期及老年人群。本文通过采用轻度不可预见性的应激模型+甲状腺素的方法，造成大鼠抑郁阴虚状态，观察滋肾益脑方对肾阴虚大鼠抑郁模型大鼠行为学及脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B(TrKB)基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物 健康SD大鼠，雌雄各半，体重170～190 g(购自长沙开福区东创科技服务部)。

1.2药物及试剂 滋肾益脑方临床用量为80 g/d，按处方称取药材(湖南中医药大学附属医院提供熟地15 g，何首乌15 g，郁金10 g，丹参15 g，当归15 g，石斛10 g等)，水煎2次，过滤，合并滤液，浓缩成相应浓度(浸膏)，4℃保存备用；盐酸氟西汀胶囊(PATHEON France，批号：0972A)；甲状腺素片(济南维尔康生化制药有限公司，批号：05055050)；琼脂糖(西班牙)，DL2000 DNA Marker、dNTP(Genstar)，引物(上海生工)，Trizol(Invitrogen)，逆转录试剂盒(Fermentas)，EDTA、Tris(Sigma)，Taq酶(Genstar)。

1.3仪器 敞箱 (自制)由不透明材料制成，底面为100 cm×100 cm的正方形，被等分为25个等边方格，高50 cm；电子天平(型号：ES-C-600电子天平，湘仪天平仪器有限公司)；低温大容量离心机(中国科学技术大学科技实业有限公司型号：KDC-2046)；PCR仪(eppendorf公司)，电泳仪、水平琼脂糖电泳槽(北京六一公司)。

1.4方法

1.4.1分组 动物分组试验前，进行敞箱试验和液体消耗试验，根据敞箱试验和液体消耗试验的结果筛选大鼠，共40只，结合前期试验结果滋肾益脑方中、高剂量组抗抑郁疗效优于低剂量组，故本实验随机分为5组：正常组、模型组、盐酸氟西汀组(氟西汀组)、滋肾益脑方中剂量组(中剂量组)、滋肾益脑方高剂量组(高剂量组)，每组8只。

1.4.2造模 参考文献〔2～4〕进行造模，采用灌胃甲状腺素合并慢性轻度，不可预见性应激法，建立“肾阴虚抑郁病证”复合模型。造模方法：将4℃冰水游泳5 min，禁食禁水24 h，夹尾1 min，明暗颠倒24 h，陌生物品(如塑料杯、碎布头等)，潮湿垫料、鼠笼倾，40℃高温环境，电击足底(18 V)，Morris水迷宫。共8种刺激随机安排在21 d中，每日1种，使大鼠不能预料刺激发生，以避免产生适应性。同时，每日灌胃甲状腺素2.5 mg·kg-1·d-1，造成大鼠抑郁+肾阴虚状态。各组从实验第7日起，氟西汀组给予盐酸氟西汀3.6 mg·kg-1·d-1；滋肾益脑方中、高剂量分别给予滋肾益脑方14.4、28.8 g 生药·kg-1·d-1；正常组与模型组均灌胃等容量蒸馏水。各组灌胃容量均为10 ml·kg-1·d-1，1次/d，连续14 d。除正常组外均单笼饲养。

1.4.3一般状态及体重变化 观察模型动物一般状态及体重变化实验过程中观察大鼠外表、性情、活动情况、饮水量、大便情况，每周测1次体重。

1.4.4液体消耗试验〔2,3〕试验前，在隔噪音、安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，两瓶均装有1%蔗糖水，随后的24 h，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯水。23 h禁食禁水后，进行动物的基础糖纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水。60 min后，取走2瓶并称重。计算动物的糖水偏爱(糖水消耗量/总液体消耗×100%)。

1.4.5敞箱试验〔2,3〕安静的房间内进行此项试验观察。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠5 min内中央格停留时间(S)、穿越格数(四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分)、后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分)、清洁运动记数、粪便粒数。彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。每只观察1次。每周进行1次敞箱试验。

1.4.6BDNF、TrKB基因表达的检测

1.4.6.1RNA提取 每组取3只进行测定。海马总RNA采用Trizol 1次性抽提法。取大鼠左侧海马置入1 ml Trizol中，冰上匀浆，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡后离心，取上清加等体积异丙醇，-20℃静置20 min，低温离心，沉淀中用75%乙醇洗，低温离心，去上清，空气干燥5～10 min，加50 μl DEPC处理水溶解沉淀，紫外分光光度计测定浓度。经凝胶电泳鉴定，两条rRNA(18 S、28 S)条带清晰，紫外分光光度计测A260/A280比值于1.8～2.0之间用于以下实验。

1.4.6.2逆转录反应体系 在20 μl逆转录反应体系中，RNA样品约3 μg，1 μl自由引物，5×反应缓冲液4 μl，RNase抑制剂1 μl，dNTP 2 μl，M-MLV逆转录酶(200 units)1 μl，42℃，1 h 30 min；72℃反应10 min。所得cDNA于-20℃冻存。

1.4.6.3引物设计 根据GenBank中目的基因所对应的cDNA表达序列和提供的相关资料，利用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物。①BDNF引物(产物长度为550 bp)：正义链：GTTATTTCATACTTCGGTTGC，反义链： TGGGATTACACTTGGTCTCG；②TrKB 引物(产物长度为148 bp)：正义链：GGCTTATGCTTGCTGGTC，反义链：CTGGGTCAATGCTGTTAGGT。

1.4.6.4PCR扩增 取1 μl cDNA上、下游引物各0.5 μl，Taq DNA聚合物0.15 μl，加入10 μl反应体系中扩增：(1)BDNF：反应条件为94℃，先变性4 min，然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，最后72℃ 5 min。(2)TrKB：反应条件为94℃，先变性4 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，最后72℃ 5 min。

1.4.6.5PCR产物的分析 经凝胶成像及图像分析系统扫描后，以大鼠海马β-actin为参照，求出其相对灰度值。

2 结 果

2.1滋肾益脑方对抑郁大鼠体重及行为学指标的影响 实验前，各组动物测得的体量、敞箱实验、液体消耗试验各项指标相近(P>0.05)。治疗14 d(应激第21天)，与正常组比较，模型组体重、敞箱实验、液体消耗试验各项指标差异均有显著性(P<0.01)，提示抑郁模型复制成功。与模型组比较，敞箱试验中氟西汀组、滋肾益脑方中、高剂量组在各项指标上差异均有显著性(P<0.01)，说明滋肾益脑方能改善模型动物的抑郁行为。与氟西汀组比较，滋肾益脑方各剂量组各指标无统计学差异；中剂量组的体重、糖水偏好均明显增加，两组比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1 治疗后各组大鼠行为学指标的比较

2.2滋肾益脑方对抑郁大鼠BDNF基因表达的影响 在治疗14 d(应激第21天)后，与正常组比较，模型组大鼠BDNF的mRNA表达明显降低(0.550±0.62 vs 0.729±0.311，P<0.05)；与模型组比较，氟西汀组、滋肾益脑方中、高剂量组的BDNF mRNA表达升高(0.641±0.49，0.639±0.57，0.684±0.367)，但氟西汀组、滋肾益脑方中剂量组与模型组比较无明显差异(P>0.05)，高剂量组与模型组比较有明显差异(P<0.01)。滋肾益脑方组与氟西汀组大鼠海马BDNF mRNA表达比较无明显差异(P>0.05)，但海马BDNF mRNA表达由高到低依次是高剂量组、氟西汀组、中剂量组。见图1。

图1 滋肾益脑方对抑郁大鼠BDNF mRNA表达的影响

2.3滋肾益脑方对抑郁大鼠TrKB基因表达的影响 在治疗14 d(应激第21天)后，与正常组比较，模型组大鼠TrKB的mRNA表达明显降低(0.245±0.023 vs 0.512±0.105，P<0.05)；与模型组比较，氟西汀组、忧虑康中、高剂量组的TrKB mRNA表达升高(0.447±0.031，0.401±0.078，0.453±0.03，P<0.05，P<0.01)。滋肾益脑方组与氟西汀组大鼠海马TrKB mRNA表达比较均无明显差异(P>0.05)，但海马TrKB mRNA表达由高到低依次是高剂量组、氟西汀组、中剂量组。见图2。

图2 滋肾益脑方对抑郁大鼠TrKB mRNA表达的影响

3 讨 论

目前DEP的病理生理及发病机制与海马结构及功能变化等有密切关系。已有研究证实，慢性应激大鼠中可以导致海马神经元萎缩、变性及死亡，且应激以及抑郁状态使脑区神经元尤其是海马区再生出现障碍，这可能是DEP发生的机制之一。

BDNF是一种主要的神经营养因子，在海马和皮层中高水平表达，是神经元再生的关键因素〔5，6〕。研究证据表明BDNF表达水平下降参与DEP的某些病理生理过程。TrKB是BDNF的特异的功能受体，BDNF的作用必须通过TrKB实现。TrKB是由酪氨酸激酶原癌基因编码的一种神经营养素家族高亲和力受体，广泛分布于中枢神经系统，对神经元的生存、生长、分化有重要的影响〔7〕。TrKB主要作为神经营养素家族中BDNF和神经营养因子4/5(NT-4/5) 的特异性高亲和力受体。

外源性DEP大鼠(应用慢性温和性刺激制备)及成年内源性DEP大鼠(幼鼠腹腔注射五羟色胺再摄取抑制剂-氯米帕明制备)模型，与正常对照组相比，内、外源性DEP大鼠脑内BDNF水平均较正常组大鼠明显降低〔8〕。免疫组化法检测抑郁模型大鼠海马CA3区BDNF含量及表达的总面积、阳性细胞数和平均光密度均明显降低〔9，10〕。张大鹏等〔11〕研究发现，慢性应激致大鼠前脑皮质细胞BDNF和TrKB表达减少，褪黑激素对其进行干预，大鼠相应地前脑皮质BDNF和TrkB的表达上调。本实验研究与上述报道结果一致，以采用灌胃甲状腺素合并慢性不可预见性应激制成肾阴虚抑郁动物模型后，模型组海马区BDNF、TrKB的基因表达明显下调，氟西汀、滋肾益脑方均可在对抗慢性应激引起的行为学变化的同时，使海马区BDNF、TrKB基因表达明显升高，滋肾益脑方高剂量组在BDNF、TrkB基因表达方面明显尤于氟西汀、滋肾益脑方剂中量组。本文结果提示，肝肾阴虚抑郁模型脑内海马区TrkB的表达减少，可能是神经细胞可塑性下降、细胞凋亡与再生平衡失调的原因之一，进而导致局部性结构和功能障碍，引起认知、情感等改变。滋肾益脑的作用机制之一可能是通过促进海马BDNF、TrKB基因表达上调。

4 参考文献

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11张大鹏，许豪勤，陈 艳，等.褪黑激素对慢性应激性抑郁症大鼠前脑皮质BDNF、TrkB表达及认知行为的影响〔J〕.江苏大学学报(医学版)，2009；19(1)：1-4.