β-Catenin、Skp2和p27在老年肝细胞癌中的表达及相关性

靳文剑 张焜和 陈火国 罗庆丰

(南昌大学医学院消化系,江西 南昌 330029)

肝细胞癌(HCC)是我国常见恶性肿瘤之一，肿瘤相关死亡率居第3位〔1〕。β-连环蛋白(β-Catenin)是Wnt信号通路的核心元件，在多种肿瘤组织中β-Catenin通过突变维持蛋白稳定性，导致Wnt-β/Catenin信号通路异常激活，从而促进肿瘤进展〔2〕。S期激酶相关蛋白2(Skp2)是泛素连接酶E3复合体中负责底物识别的关键因子，特异性降解多种蛋白因子，导致细胞恶性增殖〔3〕。p27是Skp2的靶蛋白之一，其通过将细胞周期阻滞在G1期从而抑制细胞增殖，其表达异常是肿瘤形成的重要因素之一〔3〕。本研究采用免疫组织化学染色技术检测β-Catenin、Skp2和p27蛋白在老年HCC及对应癌旁组织中的表达情况，分析三者在HCC组织中的表达与临床病理参数的关系，并进一步探讨β-Catenin、Skp2和p27蛋白表达之间的相关性，为临床提供具有潜在应用价值的分子标记和治疗新靶点。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2008年1月至2012年12月我院病理科保存的HCC及对应癌旁组织标本56例，其中男44例，女12例，年龄60～78〔平均(61±4.5)〕岁；Edmonson分级：Ⅰ+Ⅱ级32例，Ⅲ+Ⅳ级24例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ级33例，Ⅲ+Ⅳ级23例。所有患者术前均未行放射、化疗及射频消融治疗，所有组织标本经术后病理学证实为HCC。

1.2免疫组织化学染色 兔抗人β-Catenin多克隆抗体(sc-1496-R)、Skp2多克隆抗体(sc-7164)和p27多克隆抗体(sc-528)均购自美国Santa Cruz公司；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。对石蜡块进行4 μm连续切片，经过二甲苯脱蜡和酒精梯度水化后，抗原修复液(柠檬酸+柠檬酸钠)进行热抗原修复，3% H2O2孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，10%山羊血清室温封闭30 min，将以1∶100比例稀释的β-Catenin、Skp2和p27抗体加于标本后，4℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3 min 3次，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液，室温孵育30 min。PBS冲洗3 min 3次，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30 min。DAB显色，苏木素轻度复染，1%盐酸酒精分化，稀氨水反蓝，酒精和二甲苯梯度脱水至透明，中性树胶封片。显微镜下观察、成像系统拍照，统计分析实验结果。用染色强度联合阳性细胞百分比进行评分；染色强度分为4个等级：阴性=0分；弱阳性=1分；中度=2分；强阳性=3分。阳性细胞百分比分5个等级：≤5%=0分；6%～25%=1分；26%～50%=2分；51%～75%=3分；>75%=4分。染色强度和阳性细胞百分比评分相乘≥1分则认为β-Catenin、Skp2或p27蛋白阳性表达〔4〕。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0软件，蛋白表达差异和临床病理参数分析均采用χ2检验或Fisher精确概率法，蛋白表达相关性分析采用Spearman等级相关。

2 结 果

2.1HCC及对应癌旁组织中β-Catenin、Skp2和p27的表达 β-Catenin、Skp2和p27在HCC组织中分别为55.4%(31/56)、44.6%(25/56)和14.3%(8/56)，在对应癌旁组织中分别为14.3%(8/56)、10.7%(6/56)和53.6%(30/56)，差异均有统计学意义(χ2=20.811、16.102、19.277，均P=0.000)。β-Catenin主要定位于细胞膜，Skp2主要定位于细胞核，而p27主要定位细胞质和胞膜。见图1。

图1 β-Catenin、Skp2和p27在各种组织中的表达(SP，×400)

2.2β-Catenin、Skp2和p27蛋白表达与HCC临床病理参数的关系 HCC组织中β-Catenin阳性表达与肝内转移和Edmonson分级有关(χ2=21.624、22.406，P=0.000)；Skp2阳性表达与肝内转移、Edmonson分级和TNM分期有关(χ2=28.561、25.441、34.387，均P=0.000)；p27阳性表达与Edmonson分级和TNM分期有关(P=0.008、0.016)。见表1。

2.3β-Catenin、Skp2和p27蛋白在HCC组织中表达的相关性 HCC组织中，β-Catenin与Skp2蛋白表达呈显著正相关(r=0.571，P=0.002)；β-Catenin与p27蛋白表达呈显著负相关(r=-0.429，P=0.029)；Skp2与p27蛋白表达呈显著负相关(r=-0.667，P=0.001)。

表1 β-Catenin、Skp2和p27蛋白表达水平与HCC临床病理参数的关系(n=56,n)

1)Fisher精确概率法

3 讨 论

β-Catenin最早是在结直肠癌中被发现与肿瘤形成相关，其与腺瘤性结肠息肉病(APC)肿瘤抑制基因产物形成复合体，研究发现包含野生型APC基因的结肠癌中存在致癌突变的β-catenin基因，提示了β-Catenin在调控细胞增殖过程中的重要性〔5〕。突变的β-Catenin蛋白能够逃避APC靶向介导的降解从而更加稳定，尽管β-Catenin突变率较低，但已经发现在黑色素瘤、HCC、肝母细胞瘤、Wilm's肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、髓母细胞瘤、甲状腺癌、胃癌、肾癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和毛母质瘤等一系列肿瘤中存在β-Catenin突变，这些数据高度提示β-Catenin信号通路反常可能与多种人类恶性肿瘤的发生相关〔2〕。另外在大部分人类肿瘤中都存在β-Catenin下游靶蛋白如c-Myc和细胞周期蛋白(cyclin)D1过表达，更进一步支持β-Catenin在肿瘤发生、发展中的重要性〔6〕。本研究提示β-Catenin可能与HCC发生发展和转移有关。

p27是细胞周期抑制蛋白CIP/KIP家族成员，通过与细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖激酶复合体结合抑制其活性〔7〕。p27高表达导致细胞周期阻滞在G1期，细胞停止增殖，在一系列的肿瘤组织中发现了p27表达异常，提示p27低表达在促进肿瘤形成中发挥重要作用〔8〕。p27表达受转录和转录后水平机制调控，而最重要的调控机制是Skp2介导的泛素依赖蛋白水解通路，F-盒蛋白Skp2靶向降解p27、p21、p57和p130，在细胞周期中Skp2与p27的表达水平相反，Skp2-p27轴参与了许多肿瘤的形成和进展〔9〕。Skp2在淋巴瘤形成中发挥重要作用，在人类淋巴瘤组织中其表达与肿瘤病理分级呈正相关而与p27表达呈负相关〔10〕。本研究也发现，HCC组织中Skp2阳性表达率显著高于对应的癌旁组织，而p27的表达情况则相反。另外结果提示Skp2-p27轴参也与了HCC的发生发展。

研究发现p27表达缺失诱导Wnt/β-Catenin信号通路活化，共表达p27可以抑制β-Catenin诱导的Smad7表达，提示Skp2-p27轴与β-Catenin之间存在相互作用〔11〕。本研究结果提示β-Catenin、Skp2和p27在HCC发生发展和转移中可能相互作用。

综上，β-Catenin、Skp2和p27在老年HCC组织中的表达异常且与恶性病理参数有关，三者异常表达密切相关，并可能成为具有潜在应用价值的分子标记和治疗新靶点。

4 参考文献

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3靳文剑,张焜和,陈火国,等. 肝细胞癌患者肝癌组织S期激酶相关蛋白2、p27表达与临床病理特征的关系〔J〕. 中国老年学杂志,2012;32(19):4163-5.

4周振宇,涂康生,张 竞,等. Fbxw7在肝癌中的表达及与肝癌细胞增殖相关性研究〔J〕. 细胞与分子免疫学杂志,2012;28(12):1303-6.

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