脂联素基因多态性与代谢综合征和血浆脂联素水平的相关性

黄凤珍 刘 军 庞 栋 卜培莉

(济南医院内一科，山东 济南 250013)

代谢综合征(MS)有多个易感基因，如脂联素基因、浆细胞分化抗原-1基因、过氧化酶增殖物激活受体基因等。新近全基因组扫描在染色体3q27区绘制了一个MS的易感位点〔1〕，而编码脂联素(APN)的基因正位于此，提示APN基因可能是MS的一个相关基因。国外多项研究发现，APN基因以+45位点(外显子2)T→G多态性和+276位点(内含子2)G→T多态性相对常见，并证实SNP+45T/G、SNP+276G/T多态性与MS有关，而国内APN基因多态性与MS和APN水平的相关性鲜见报道。本研究探讨了APN基因 SNP+45T/G和SNP+276G/T的基因型分布及其与MS和血浆APN水平的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 从本院2 025例老年人中选取年龄、性别匹配的汉族MS组448例，男328例，女120例，年龄65～87〔平均(75.42±3.58)〕岁；正常对照组(NC组)400例，男298例，女102例，年龄66～92〔平均(76.94±2.76)〕岁。MS诊断标准采用IDF(2005)标准，以中心性肥胖(腹围)为诊断前提，肥胖诊断：腰围(WC)>90 cm(男)、>80 cm(女)，同时具备以下四项指标中任意两项：①甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L或已接受治疗；②高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L(40 mg/dl)(男)或<1.1 mmol/L (50 mg/dl)(女)，或已接受治疗；③血压：收缩压(SBP)≥130 mmHg或舒张压(DBP)≥85 mmHg，或已接受相应治疗或此前已诊断高血压；④糖代谢异常：空腹血糖(FPG)≥5.6 mmol/L(100 mg/dl)或已接受相应治疗或此前已诊断2型糖尿病。NC组为不具备上述5项中的任何一项者。两组均排除冠心病、肝肾功能异常、肿瘤等疾病。

1.2病史采集、体格检查 对所有研究对象进行问卷调查，并测量身高、体重、WC、臀围(HC)、血压，抽取空腹静脉血5 ml，其中3 ml用于测血糖、血脂、肝功、肾功，2 ml放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝试管中,离心分离血浆和血液有形成分在-80℃冰箱保存，供测APN和提取DNA之用。

1.3实验方法 ①外周血DNA提取：TIANamp Blood DNA Kit(TIANGEN公司) 提取DNA，DNA保存于-20℃冰箱备用。②聚合酶链反应(PCR)扩增：SNP+276位点上游引物为：5′-CTCC TAC ACT GAT ATA AAC TAT ATG AAT-3′，下游引物为：5′-AATG TAC TGG GAA TAG GGA TGA-3′；SNP+45位点上游引物：5′-CTC CCT GTG TCT AGG CCT TAG-3′，下游引物：5′-TAG AAG TAG ACT CTG CTG AGA TG-3′，由博尚生物技术有限公司合成。PCR反应体系：总反应体积25 μl,含DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,ddH2O 9.5 μl,在PCR仪上扩增。PCR程序：SNP+276为预变性94℃ 5 min,循环：变性94℃ 45 s,退火54℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，共35个循环，再72℃延伸7 min，4℃保存。SNP+45为预变性94℃ 5 min，循环：变性94℃ 40 s,退火58℃ 40 s，延伸72℃ 45 s，共37个循环，再72℃延伸7 min，4℃保存。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，溴乙啶染色，自动凝胶成像系统鉴定。③确定基因型 SNP+276：取6 μl PCR产物与1 μl EcoRⅠ(大连宝生物)、10×H buffer 2 μl、ddH2O 11 μl 37℃酶切过夜，2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，自动凝胶成像系统鉴定基因型。SNP+45：取6 μl PCR产物与1 μl Sma I(大连宝生物)、10×T buffer 2 μl、0.1% BSA 2 μl、ddH2O 9 μl 30℃酶切4 h，2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，自动凝胶成像系统鉴定。

1.4统计学方法 用SPSS12.0统计软件包。均数间比较用t检验；直接计数法计算各组等位基因和基因型频率，组间基因型、等位基因频率分布比较用pearsonχ2检验；遗传平衡吻合度χ2检验群体基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 结 果

2.1两组体格检查及血生化指标比较 两组比较体重指数(BMI)、SBP、DBP、WC、TG、HDL-C、FPG均有差异(P均=0.000)，见表1。

2.2APN基因SNP+276G/T的电泳分型 PCR扩增结果为245 bp的片段，含T等位基因的片段存在EcoR Ⅰ的酶切位点。当基因型为TT时，酶切产物电泳后出现28 bp和217 bp两条带；基因型为GG时，只有245 bp一条带；基因型为TG时，存在28 bp、217 bp和245 bp三条带。28 bp片段太小，酶切后显示不清。见图1。

2.3APN基因SNP+45T/G的电泳分型 PCR扩增结果为372 bp的片段，经Sma Ⅰ酶切后产生三种基因型：野生型(T/T)，杂合子型(T/G)，纯合子突变型(G/G)。含G等位基因的片段被酶切为209 bp和163 bp两个片段。故若为纯合G等位基因，被切为209 bp和163 bp两个片段；为T、G杂合基因，酶切后有372 bp、209 bp和163 bp三个片段；为纯合T等位基因，酶切后只有372 bp一个片段。见图2。

图1 APN基因SNP+276 G/T经EcoR Ⅰ酶切图谱

图2 APN基因SNP+45 T/G经Sma Ⅰ酶切图谱

2.4Hardy-Weinberg平衡检验 两组分别进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，P均>0.05，表示两组样本均来自遗传平衡的总体，符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.5APN基因SNP+276G/T基因型与等位基因的分布 两组在基因型分布上有统计学差异(P<0.05)。MS组T、G等位基因频率比较有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 两组体格检查及血生化指标比较±s)

表2 两组APN基因SNP+276 G/T基因型及等位基因频率比较〔n(%)〕

2.6APN基因SNP+45T/G基因型与等位基因的分布 两组在基因型分布上无统计学差异(P﹥0.05)。两组T、G等位基因频率比较无统计学意义(P﹥0.05)。见表3。

2.7两组血浆APN水平比较 分别从MS组、NC组中随机抽取174例进行血浆APN水平测定，两组年龄、性别匹配。MS组APN水平均值为(12.57±2.81) μg/ml,NC组为(13.55±1.50) μg/ml，MS组显著低于NC组(P=0.008)。

2.8男性和女性血浆APN水平比较 整体人群中，男性血浆APN水平均值为(12.88±2.36) μg/ml，女性为(14.33±1.88) μg/ml；MS组中，男性为(12.10±2.93) μg/ml，女性为(13.87±1.72)μg/ml；NC组中，男性为(13.36±1.79) μg/ml，女性为(14.59±1.86) μg/ml，各组男性和女性APN水平比较，女性显著高于男性(P均<0.05)。校正WC、WHR及HDL-C后，这种差异仍然具有统计学意义(P均<0.05)。

2.9APN基因SNP+45T/G和SNP+276G/T与血浆APN水平之间的关系 SNP+45位点中，TT基因型的APN水平为(12.87±2.42) μg/ml，非TT型为(13.78±2.07) μg/ml，TT基因型显著低于非TT基因型(P﹤0.05)；SNP+276位点中，GG基因型的APN水平为(13.24±2.30) μg/ml，非GG型为(13.38±2.32) μg/ml，两者比较无统计学差异(P>0.05)。

表3 两组APN基因+45 T/G基因型及

2.10MS危险因素Logistic回归模型 以MS作为因变量，SNP+45和SNP+276位点基因型、年龄、性别、血压、FPG、BMI等作为自变量，进行多因素逐步Logistic回归分析，BMI、DBP、FPG、TG、+276位点基因型进入回归方程，表明SNP+276位点为MS发病的危险因素。见表4。

表4 MS危险因素Logistic回归分析

3 讨 论

MS作为多重心血管危险因素的聚集体，主要临床表现有腹型肥胖、高血压、血脂异常、高血糖等，它是引发心脑血管事件的高危因素，也是导致死亡和残疾的主要原因〔2〕。MS的发病除了环境因素，遗传因素在发病中的作用已得到证实。MS的患病率在不同人种之间差异显著，根据世界卫生组织(WHO)标准，20岁以上美国人群的患病率华裔为14%～18%、欧洲裔为24%、阿拉伯和非洲裔为28%、墨西哥裔为38%〔3〕。因此，遗传因素在MS发生发展中起重要作用，特别是与MS候选基因单核苷酸多态性位点的相关研究是近几年的研究热点。胰岛素抵抗(IR)是MS的一个重要发病机制，加之基因组扫描连锁分析发现APN基因所在的人染色体3q27区与MS的多种表型密切相关〔1〕，提示APN基因可能与MS存在某种相关性。对5个不同人种的研究(日本人、德国人、法国人、美国人及瑞典高加索人)都显示APN基因与IR和MS有关。但是该基因与IR和MS相关的单核苷酸多态性在不同种族报道不一，提示在不同种族之间APN基因改变受遗传背景和环境因素的共同作用影响。本研究结果显示，SNP+276G/T与MS的发病相关，GG基因型个体发生MS的危险性高于TT基因型；未发现SNP+45T/G与MS的发病相关。这与Yang等〔4～6〕报道不同，而与高加索人、突尼斯人〔7〕和韩国人〔8〕的研究相似。

自Scherer等〔9〕发现APN以来，对其认识愈来愈深入，它具有改善胰岛素敏感性，抗高血糖、抗动脉粥样硬化等效应。大量临床研究显示血浆APN水平与血糖、TG及肥胖程度负相关，与胰岛素敏感性和HDL-C正相关〔10～12〕。APN可能通过提高胰岛素敏感性、改善糖脂代谢而对上述疾病起到保护作用。

Comuzzie等〔13〕报道血浆APN水平具有很强的遗传倾向，通过基因组扫描发现了2个主要和4个可能的影响APN水平的区域，其中一个位于3号染色体。此后多个国外研究报道3号染色体APN基因变异与血浆APN水平有关。有研究报道SNP+45位点T和SNP+276位点G等位基因携带者血浆APN水平降低〔14，15〕。本研究还表明，血浆APN水平存在明显的性别差异，女性高于男性，这与大量前期研究结果相符〔16〕。这种性别差异一方面与性激素有关，男性激素对APN基因表达有抑制作用〔17〕；另一方面可能与体脂分布和构成的性别差异有关，并且已有研究表明女性脂肪组织APN表达明显高于男性〔18〕。本研究显示血浆APN水平与WC、腰臀比(WHR)负相关，而与HDL-C正相关。

本研究也进一步探讨了APN基因+45和+276位点基因多态性与血浆APN水平之间的关系：+45位点TT基因型个体血浆APN水平显著低于非TT基因型个体，与上述报道相符；+276位点GG基因型个体血浆APN水平与非GG基因型个体相比无统计学差异，与上述报道不符，这可能与种族和地区差异或测定血浆APN水平例数较少有关。

综上，本研究证实APN基因+276G/T多态性与MS的发病有关，可能是汉族人群发生MS的一个候选基因。而+45T/G多态性与MS的发病可能无相关性。高APN水平可能是MS发病的一个保护性因素，检测血浆APN有望成为预测MS发生的敏感指标之一。

4 参考文献

1Kissebah AH，Sonnenberg GE，Myklebust J，etal.Quantitative trait loci on chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000；97(26)：14478-83.

2Lakka HM，Laaksonen DE，Lakka TA，etal.The metabolic syndrome and total cardiovascular disease mortatlity in middle-aged men〔J〕. JAMA，2002；288(21)：2709-16.

3Ford ES，Giles WH，Mokdad AH.Increasing prevalence of the metabolic syndrome among U.S.adults〔J〕.Diabet Care，2004；27(10)：2444-9.

4Yang WS，Yang YC，Chen CL，etal.Adiponectin SNP276 is associated with obesity， the metabolic syndrome，and diabetes in the elderly〔J〕.Am J Clin Nutr，2007；86(2)：509-13.

5Iris MH，Stefanie AW，Henning G，etal.Genetic architecture of the APM1 gene and its influence on adiponectin plasma levels and parameters of the metabolic syndrome in 1，727 healthy Caucasians〔J〕. Diabetes，2006；55(2)：375-84.

6Li X，Wei D，He H，etal.Association of the adiponectin gene (ADIPOQ) +45 T > G polymorphism with the metabolic syndrome among Han Chinese in Sichuan province of China〔J〕.Asia Pac J Clin Nutr，2012；21(2)：296-301.

7Boumaiza I，Omezzine A，Rejeb J，etal.Association between eight adiponectin polymorphisms，obesity，and metabolic syndrome parameters in Tunisian volunteers〔J〕.Metab Syndr Relat Disord，2011；9(6)：419-26.

8Hwang JY，Park JE，Choi YJ，etal.SNP276G>T polymorphism in the adiponectin gene is associated with metabolic syndrome in patients with type II diabetes mellitus in Korea〔J〕.Eur J Clin Nutr，2010；64(1)：105-7.

9Scherer PE，Williams S，Fogliano M，etal.A novel serum protein similar to Clq，produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995；270(45)：26746-9.

10Daimon M，Oizumi T，Saitoh T，etal.Decreased serum levels of adipnectin are a risk factor for the progression to type 2 diabetes in the Japanese population：the Funagata study〔J〕.Diabetes Care，2003；26(7)：2015-20.

11Tschritter O，Fritsche A，Thamer C，etal.Plasma adiponectin concentrations predict insulin sensitivity of both glucose and lipid metabolism〔J〕. Diabetes，2003；52(2)：239-43.

12Jang Y，Chae JS，Koh SJ，etal.The influence of the adiponectin gene on adiponectin concentrations and parameters of metabolic syndrome in non-diabetic Korean women〔J〕.Clin Chim Acta，2008；391(1-2)：85-90.

13Comuzzie AG，Funahashi T，Sonnenberg G，etal.The genetic basis of plasma variation in adiponectin，a global endophenotype for obesity and the metabolic syndrome〔J〕.J Clin Endocrino Metab，2001；86(9)：4321-5.

14Kern PA，Di Gregorio GB，Lu T，etal.Adiponectin expression from human adipose tissue：relation to obesity，insulin resistance，and tumor necrosis factor- alpha expression〔J〕.Diabetes，2003；52(7)：1779-85.

15Mackevics V，Heid IM，Wagner SA，etal.The adiponectin gene is associated with adiponectin levels but not with characteristics of the insulin resistance syndrome in healthy Caucasians〔J〕.Eur J Hum Genet，2006；14(3)：349-56.

16洪 洁，顾卫琼，张翼飞，等.胰岛素抵抗综合征患者血清脂联素和胰岛素敏感性的相关性研究〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2003；19(3)：173-6.

17Kern PA，Di Gregorio GB，Lu T，etal.Adiponectin expression from human adipose tissue：relation to obesity，insulin resistance，and tumor necrosis factor- alpha expression〔J〕.Diabetes，2003；52(7)：1779-85.

18Gu HF，Abulaiti A，Ostenson CG，etal.Single nucleotide polymorphisms in the proximal promoter region of the adiponectin (apMl) gene are associated with type 2 diabetes in Swedish caucasians〔J〕.Diabetes，2004；53(Suppl 1)：S31-5.