Caspase8及caspase3单核苷酸多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的相关性

阎 瑾 哈敏文

(辽宁医学院第一附属医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000)

肺癌的发生率及死亡率一直居高不下。铂类药物作为各种实体瘤治疗的有效药物，同时却也存在对其敏感性差及副反应不能耐受等诸多问题，究其原因，可能与肿瘤患者的个体差异有关。为了提高疗效并降低患者副反应发生，更进一步发挥肿瘤患者个体化治疗的优势，临床上迫切需要一个预测因子来平衡化疗敏感性与副反应之间的关系。半胱氨酸蛋白酶(caspases)目前确认至少有11种，caspase8参与细胞凋亡的起始，而caspase3执行细胞凋亡。caspase是凋亡信号转导的共同通路，呈“瀑布式”级联激活，最终引发细胞凋亡，其中caspase3起到核心作用。研究显示caspase家族多个成员的单核苷酸多态性(SNP)与肿瘤患者的预后及耐药有关〔1，2〕。本研究通过对晚期非小细胞胞癌(NSCLC)患者caspase8及caspase3的SNP分型，探讨其不同基因型与铂类化疗敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2008年1月至2011年6月在辽宁医学院附属第一医院肿瘤内科经细胞学或组织学确诊的NSCLC初治患者143例。纳入标准：经CT等影像学检查证实有一处及以上转移病灶，化疗前血常规及生化检查指标正常，心电图正常，功能状态(PS)评分0～2分，且均接受含铂的联合化疗方案，并有完整的随访资料。患者年龄30～83岁，均为中国汉族人；其中，男84例，女59例；鳞癌41例，腺癌88例，其他(腺鳞癌、支气管肺泡癌)14例；ⅢB期38例，Ⅳ期105例(AJCC2009年分期标准)。

1.2化疗方案 所有患者接受含铂方案化疗，具体方案如下：GP 88例，TP/DP 39例，NP 9例，培美曲塞+顺铂7例，具体剂量以体表面积计算。每3～4 w重复1次，所有患者至少完成2个周期化疗，平均接受4～6个周期化疗。

1.3疗效评估与随访 根据实体肿瘤瘤评价标准(RECIST)实体瘤近期客观疗效评价标准，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)，通过行胸部增强CT、头CT，彩超等检查进行判断，CR+PR为有效，SD+PD为无效。远期疗效评价指标无进展生存期(PFS)，为患者入组至疾病进展或死亡日期。随访时间为患者入组开始化疗之日起，每2～3个周期化疗后或出现疾病进展相关临床症状时复查，化疗结束后每3个月或出现临床症状时复查，直至明确疾病进展，或死亡的日期。随访时进行肺CT、头CT、重要脏器及淋巴结超声检查，必要时MRI及PET/CT检查。所有患者均采用门诊或住院随访方式。

1.4方法

1.4.1抽提人基因组DNA 收集患者化疗前抗凝静脉血标本，应用天根血基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。

1.4.2pcr及酶切 pcr反应体系：上下游引物各0.5 μl，基因组DNA 1 μl，pcr mix 3.5 μl，灭菌双蒸水4.5 μl，共10 μl。94 ℃预变性3 min，94℃ 30 s，退火温度下30 s，72℃延伸30 s，32个循环，72℃延伸7 min。取pcr产物5 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳100 V 40 min见单一清晰条带。酶切反应体系： pcr产物10 μl，缓冲液2 μl，相应限制性内切酶0.5 μl，灭菌双蒸水补至25 μl，相应酶切温度下进行4 h酶切，2.5%琼脂糖凝胶电泳100 V 60 min验证酶切结果。caspase8 rs3769818正义:TCTGAGACAACCCATTTACC；反义:AGAATATCATCGCCTCTGAA；退火温度55℃；pcr产物长度194 bp；限制性内切酶SspⅠ；酶切温度37℃；rs3834129正义:CTGCATGCCAGGAGCTAAGT；反义:GCCATAGTAATTCTTGCTCTGC；退火温度58℃；pcr产物长度171/177 bp；限制性内切酶XspⅠ；酶切温度37℃；caspase3 rs4647693正义:AATTCTGTTGCCACCTTTCG；反义:ACCTTCTGCGTGTTTGCTCT；退火温度56℃；pcr产物长度443 bp；限制性内切酶BsmAⅠ；酶切温度55℃。

1.4.3基因测序 将三组pcr产物的基因型各随机选出3个样本进行测序，测序工作由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.5统计学处理 采用SPSS16.0进行分析，率的比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验；对影响生存预后的联合效应采用Cox比例风险模型进行多因素分析。

2 结 果

2.13个多态位点的酶切及测序结果 见图1～3。

2.2基因型频率 143例晚期NSCLC患者caspase8及caspase3 3个位点基因频率见表1。应用Hardy-weinberg定律对其基因型分布进行遗传平衡检测，P值均>0.05。故此样本来自同一孟德尔群体。

2.3caspase8及caspase3 3个位点单核苷酸多态性与铂类化疗敏感性关系

2.3.1近期疗效 caspase3 rs4647693 SNP在近期疗效中有显著差异(P<0.05)，而caspase8 rs3769818和caspase8 rs3834129 SNP无显著差异(P>0.05)。见表2。

单一194 bp条带为C/C基因型，194 bp和160 bp为C/T基因型；测序图为杂合突变

单一171 bp条带为Del/Del，171 bp和146 bp为Del/Ins，146 bp和31 bp为Ins/Ins；测序图为Del/Ins突变

单一443 bp条带为A/A基因型，443 bp、246 bp和197 bp为A/G基因型，246 bp和197 bp为G/G基因型；测序图为杂合突变

表1 3个位点基因频率

表2 3个多态位点基因型与近期疗效关系

2.3.2远期疗效 caspase8 rs3769818 C/C基因型晚期NSCLC患者中位PFS长于C/T及T/T基因型者(164 d vs 122 d，P=0.044)；rs3834129 Del/Del基因型者中位PFS长于Del/Ins及Ins/Ins者(164 d vs 152 d，P>0.05)；rs4647693A/A基因型患者中位PFS长于A/G及G/G患者(173 d vs143 d，P=0.013)。见图4～6。

图4 rs3769818 C/C基因型与C/T+T/T基因型PFS比较

图5 rs3834129 Del/Del与Del/Ins+ Ins/Ins基因型PFS比较

进一步采用半参数分析(COX)回归模型对可能与PFS相关的7个因素进行多因素分析，显示性别、年龄、卡氏一般状况评价量表(KPS)评分和病理类型对无进展生存时间无显著影响(均P>0.05)。肿瘤分期、caspase8 rs3769818及caspase3 rs4647693 SNP对PFS存在不同程度影响(P<0.05)，因此NSCLC患者的肿瘤分期、caspase8 rs3769818及caspase3 rs4647693共同对铂类化疗的远期疗效起作用，见表3。

图6 rs4647693 A/A基因型与A/G+G/G基因型PFS比较

表3 COX回归分析

3 讨 论

恶性肿瘤的发生与发展，不仅依赖于细胞增殖速度过快，同样也依赖于其凋亡的失常。如果细胞的这种程序性死亡的机制受到抑制，则表现出细胞生存期延长，死亡率下降，从而可能转化为肿瘤。目前研究结果均显示细胞凋亡对肿瘤发生发展起着负调节作用〔3〕。

晚期NSCLC的治疗方案以铂类为基础。铂类药物的主要作用机制即为诱导细胞凋亡，它与肿瘤细胞的DNA结合，导致DNA链间或链内交联，引起DNA复制及转录障碍，从而抑制肿瘤细胞分裂。而其耐药机制主要为阻碍DNA与铂类结合和阻碍诱导凋亡，后者包括改变凋亡肿瘤基因的表达、增加DNA修复和减弱其诱导的凋亡等。caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡过程中起关键作用〔4〕。caspase的基因多态性在多种恶性肿瘤的预后研究中被认为有意义。caspase8定位于染色体2q33，是级联反应的启动因子，rs3769818和rs3834129分别在Son等〔5〕和Sun等〔6〕的研究中被证实与多种肿瘤，如肺癌、食管癌、胃癌及结直肠癌的预后存在关联。caspase3是级联反应中的效应因子，位于4q34，其多态性被证实与子宫内膜癌及肺癌有关〔7〕。Stewart〔8〕的研究证明，顺铂可以通过多种途径来激活caspase8和9，甚至能直接作用于caspase3。因而caspases多态性所导致的相应蛋白表达改变，就可能间接影响细胞凋亡功能，以致肿瘤对铂类药物的敏感性改变。这一点在Kim等〔9〕的研究中得以证明，即在结直肠癌中Caspase8的基因突变后导致细胞凋亡功能的丧失。

Caspase8 rs3769818位于内含子区，Son等〔5〕在韩国人群中开展的肺癌相关性研究和Zhang等〔10〕关于肿瘤风险的Meta分析中均未体现出显著性差异。而rs3834129在Sun的中国人群多种恶性肿瘤的研究中，6 bp的缺失被证明降低肿瘤发病风险，且能降低caspase8的转录活性，然而后续大量实验却并未提出相同证据。caspase3多态性研究尚少，一项研究中证明其多态性和单体型与乳腺癌易感性无相关性〔11〕。而国内结直肠癌研究中，caspase3位于启动子区的rs4647693多态性与预后关系亦存在差异〔12，13〕。分析本研究中SNP与PFS存在差异的原因，可能是由于其分别位于基因的内含子区剪切域附近和启动子区，通过影响剪切或基因的转录，影响蛋白表达，进而影响细胞凋亡，甚至影响铂类药物化疗敏感性。进一步的COX回归模型显示晚期NSCLC分期和caspase8 rs3769818、caspase3 rs4647693共同影响PFS。

综上，caspase8 rs3769818和caspase3 rs4647693的单核苷酸多态性可能是晚期NSCLC铂类化疗敏感性潜在的预测因子。而三者的多态性是否能作为临床个体化治疗方案选择的依据仍需大样本量、多中心研究进一步证实。

4 参考文献

1赵 静,张 文,李文桦，等.MTHFR和ABCG2单核苷酸多态性对晚期结直肠癌一线化疗疗效的预测作用〔J〕.肿瘤，2012；30(9)：709-16.

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5Son JW,Kang HK,Chae MH，etal.Polymorphisms in the caspase 8 gene and the risk of lung cancer〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2006;169(2):121-7.

6Sun T,Gao Y,Tan W，etal.A six-nueleotide insertion-deletion Polymorphism in the CASP8 promoter is associated with susceptibility to multiple cancers〔J〕.Nat Genet，2007;39(5):605-13.

7Jang JS，Kim KM，Choi JE，etal.Identification of Polymorphisms in the Caspase 3 gene and their association with lung cancer risk〔J〕.Molecular Carcinogenesis,2008;47(5):383-90.

8Stewart DJ.Mechanisms of resistance to cisplatin and carboplatin〔J〕.Crit Rev Oncol Hematology，2007;63(1):12-31.

9Kim HS，Lee JW，Soung YH,etal.Inactivating mutations of caspase-8 gene in colorectal carcinomas〔J〕.Gastroenterology，2003；125(3):708-15.

10Zhang YJ，Zhong XP，Chen Y，etal.Association between CASP-8 gene polymorphisms and cancer risk in some Asian population based on a huge review and meta-analysis〔J〕.Genet Mol Res，2013;12(4):6466-76.

11倪 勤，刘 冰，金明娟，等.CASP3基因多态性及单体型分布与乳腺癌危险性的关联研究〔J〕.浙江大学学报医学版，2011；40(3)：259-64.

12刘 冰.环境因素、caspase凋亡通路相关基因多态性与结直肠癌风险的关联研究〔D〕.浙江大学博士论文，2010.

13雷艳荣.Caspase-3 -928A/G 基因多态性和大肠癌易感性及侵袭性的关联性研究〔D〕.华中科技大学硕士论文，2010.