番茄SSR标记在茄子及其他茄科作物上的通用性分析

汪国平，牛 玉，2，汪文毅，乐素菊，林鉴荣

（1华南农业大学园艺学院，广东广州 510642；2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737；3仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州 510225；4广州市农业科学研究院，广东广州 510308）

番茄SSR标记在茄子及其他茄科作物上的通用性分析

汪国平1，牛 玉1，2，汪文毅1，乐素菊3，林鉴荣4

（1华南农业大学园艺学院，广东广州 510642；2中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州 571737；3仲恺农业工程学院生命科学学院，广东广州 510225；4广州市农业科学研究院，广东广州 510308）

【目的】利用已完成测序的番茄基因组发展大量的SSR标记，并将这些标记转移到茄子及其他茄科作物上，节省开发SSR标记的成本.【方法】本研究利用近缘物种转移法分析了番茄SSR标记在茄子及其他茄科作物上的通用性情况.【结果和结论】1 046对番茄SSR引物中有887对能在茄子基因组DNA上扩增出产物，425对引物扩增出的带型在番茄与茄子间相似程度高，标记的通用率为40.6%；EST-SSR比基因组SSR的通用性更好，前者通用率为54.5%，后者为38.9%；414个通用SSR标记被电子定位到番茄染色体上，不同染色体来源的标记通用率明显不同；93对引物在2份用于遗传图谱构建的栽培茄子亲本间表现出多态性；获得的425对通用引物在马铃薯、辣椒、枸杞上通用率分别为96.2%、78.1%、54.1%.

番茄；茄子；SSR标记；通用性；茄科蔬菜

目前，多种分子标记技术可以用于分子遗传研究，其中微卫星标记（Microsatellite），又称简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）具有多态性丰富、重复性好、检测方便、标记多呈共显性、在基因组中分散分布等特点，已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选［1］.微卫星标记已成为分子育种中最重要的遗传标记之一.

由于微卫星标记具有种族特异性，使用SSR标记的前提是要知道重复序列两侧的DNA序列，因而存在引物开发的问题.获取微卫星标记的方法主要有基因组测序法、筛选基因组文库法、微卫星富集法、数据库查找法和近缘物种转移法等5种［2］.目前茄科作物中番茄、马铃薯已经完成基因组测序［3-4］，可以发展海量的SSR标记，但在其他茄科作物上可供利用的SSR标记数目不多，还不能满足这些作物分子育种的需要，有必要发展更多的SSR标记.

近缘物种转移法是一种简便快速地发展SSR标记的方法，微卫星侧翼序列在属内种间、甚至在科内属间是保守的、相似的，因此，同种、属、科的不同物种可以使用同一种微卫星引物进行扩增.茄科作物种类较多，比较基因组学研究已经证明茄科作物间基因组保守性较强［5-7］.根据番茄基因组序列已发展了大量SSR标记，本文对这些标记在茄子及其他茄科蔬菜作物上的通用性进行了研究，以期将部分标记转移到茄子上，节省开发茄子SSR标记的成本.

1 材料与方法

1.1 植物材料及DNA提取

供试材料：栽培番茄“860”（华南农业大学园艺学院番茄课题组选育），栽培茄子“湖南小圆茄”（湖南省收集的地方品种）、“Blacknite”（澳大利亚购买的常规品种），3个材料均经多代纯化；辣椒为“东方神剑”品种，马铃薯、枸杞为广州岑村蔬菜基地采集，品种名未知.

上述材料均取1～2片幼叶，按Hemming等［8］的方法提取各植物材料的总DNA.

1.2 SSR标记及方法

共试验了1 046对番茄SSR引物.其中112对 EST-SSR引物根据SGN网站（http：∥sgn.cornell. edu）及He等［9］公布的引物序列合成；32对基因组SSR根据Suliman-Pollatschek等［10］公布的引物序列合成；902对基因组SSR由课题组根据番茄BAC末端序列、基因组序列设计，引物序列暂时未公布.

20μL PCR反应体系中包括0.15μmol·L-1的引物、200μmol·L-1dNTPs、1×PCR反应缓冲液、50～100 ng的DNA模板、1 UTaq酶.反应在PE9700型热循环仪中进行.所用的反应程序为：94℃预变性5 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，循环35次；最后72℃延伸5 min.PCR产物用6%聚丙烯酰胺变性胶电泳，250 V条件下稳压电泳约3 h；普通银染显带，数码相机照相.对扩增模糊、无扩增产物的SSR标记进行2次分析，以确保该结果不是由PCR扩增失败引起.

1.3 SSR标记电子定位

在SGN网站提供的Blastn界面将SSR引物序列与番茄基因组序列（版本2.4）进行比对，确定标记在番茄染色体上的位置.

2 结果与分析

2.1 番茄SSR引物在茄子基因组DNA上的扩增情况

根据电泳后主带的情况，在茄子基因组DNA上番茄SSR引物的扩增带型（图1）出现以下几种类型：1）扩增出较强的主带，茄子与番茄有1条主带的大小非常一致（标记SSRD105、SSR85）；2）扩增出较强的主带，茄子与番茄有1条主带的大小相差不大（标记SSR48、SSRD198）；3）扩增出多条主带，且与番茄主带无对应条带；4）扩增出多条弱带；5）不能扩增出任何条带.

试验共检测了1 046对番茄SSR引物，有887对在茄子基因组DNA上扩增出了产物，642对引物扩增出了第1、第2、第3种类型较强的主带，占总标记数的61.4%，其中第1种引物135对，第2种引物290对（163对扩增出的产物比番茄大，127对比番茄小），第1、2种引物扩增出的带型在番茄与茄子间相似程度高，可以转用到茄子上，以此得到标记的通用率为40.6%.

图1 番茄SSR引物在茄子和番茄DNA上扩增出的带型Fig.1 The band patterns of tomato SSR markers amplified on eggplant and tomato DNAs

比较EST-SSR与基因组SSR的扩增情况：试验共检测了112对番茄EST-SSR引物，结果有98对能有效扩增，95对能扩增出清晰主带，其中61对为第1、2种引物，可以在茄子上通用，通用率为54.5%；试验共检测了934对番茄基因组SSR引物，结果有789对能有效扩增，529对能扩增出清晰主带，其中364对为第1、2种引物，可以在茄子上通用，通用率为38.9%.说明EST-SSR比基因组SSR的通用性明显要好.

2.2 引物通用性与基序长度的关系

对在茄子上能通用的番茄SSR引物标记位点重复序列按基序长度进行分类，结果（图2）表明，通用SSR无论来源于EST还是基因组，2核苷酸基序出现的频率最大，3核苷酸基序出现频率次之，但2核苷酸基序出现频率基因组SSR大于EST-SSR，而3核苷酸基序出现频率是EST-SSR明显高于基因组SSR，其他核苷酸基序类型（4、5、6核苷酸）出现频率在基因组SSR和EST-SSR间差别不大.

图2 番茄SSR不同长度基序的频率分布Fig.2 The frequency distributions of differentmotifs of tomato SSR

2.3 保守SSR标记在番茄染色体上的分布

将1 046对番茄SSR引物与番茄基因组序列比对进行电子定位，结果有15对不能定位，有33对定位于染色体0（即测序后不能组装的序列），998对能定位到番茄的各条染色体上；番茄、茄子间保守的425对引物中，3对不能定位，8对定位于染色体0，414对能定位到各条染色体上.对414对标记的定位结果按EST-SSR、基因组SSR进行统计，统计结果见表1.从表1中可以看出，通用SSR标记比率在不同染色体上明显不同，染色体9上标记的通用率最高（60.5%），染色体10次之（53.3%）；而染色体7上标记的通用率最低（29.2%），其次是染色体12（31.7%）.

2.4 保守引物在2份茄子间的多态性

425对在茄子上能有效扩增的番茄引物中，有67对能在2份栽培茄子间扩增出多态条带，多态标记比率为15.8%.由此看来，尽管SSR引物的通用性较高，但在茄子不同材料上的多态性比例较低，这可能是因为用于多态性比较的2个茄子亲本都来源于栽培种，亲缘关系比较近.

在2份栽培茄子间扩增出多态性的引物中，部分标记带型表现为长度大小的差别，而且相差只有几个碱基，可能为共显性标记，但需要使用F1进行验证；部分标记带型为有无的差别，表现为显性标记特性.

2.5 保守引物在其他茄科作物上的通用性

对番茄、茄子间保守的425对SSR引物在其他茄科蔬菜上的通用性进一步检查，在马铃薯、辣椒、枸杞上分别有96.2%、78.1%、54.1%的引物能扩增出第1、2种带型.

表1 通用SSR标记在番茄染色体上的分布Tab.1 The chromosome distribution of transferable tomato SSR markers

3 讨论与结论

SSR标记在茄科作物间具有一定的通用性.邵光金等［11］证明茄子的SSR标记可以应用于番茄；陈晓莹［12］证明番茄SSR可以用于辣椒.本试验进一步证明番茄SSR标记可以应用于茄子、马铃薯、辣椒和枸杞.由于番茄、马铃薯已经进行了全基因组测序，可以发展出海量的SSR标记，将这些标记转移到其他未测序的茄科作物上，可以大大节省标记开发的成本.

目前茄子上开发出的SSR标记不多，有必要发展更多的SSR标记.Stàgel等［13］利用数据库序列发展了50对EST-SSR，其中有39对能成功扩增；Nunome等［14］于2003年通过筛选基因组文库的方法发展了37对SSR引物，其中23对能成功扩增；该课题组随后再通过筛选基因组文库的方法发展了2 265对SSR引物，但只在文章中公布了用于构建SSR遗传图谱的300多对引物序列［15-16］.卢婷等［17］用23对番茄SSR标记应用于茄子聚类分析，证明番茄SSR标记可以在茄子上部分通用.本研究进一步扩大了试用标记的数量，将425个番茄SSR标记转用到茄子上，并找到在茄子作图亲本间具有多态性的67个标记，这不仅为茄子遗传图谱构建及基因定位奠定了基础，而且可以进一步用这些标记做锚定标记，进行番茄、茄子间的比较基因组作图，这将比应用COS标记进行比较作图简便得多［5］.番茄已经完成了全基因组测序，番茄、茄子间锚定标记的获得，将为利用基因组间的微共线性发展加密标记及基因克隆提供参考.

试验中部分标记不能被电子定位，可能原因有三：一是未定位标记存在于番茄基因组测序的gap区域；二是本试验部分标记是根据番茄的BAC末端发展的，而BAC末端测序是单一read，存在一定的测序错误，和基因组序列比对不上；三是EST-SSR及来自Suliman-Pollatschek等［10］研究的基因组SSR，所用的原始番茄材料与番茄测序材料不同.

本研究发展的SSR标记通用性比十字花科作物低，崔秀敏等［18］的研究结果表明，69对不结球白菜SSR引物在芸苔属其他8种作物上的通用性扩增率在49.3%～85.5%，而且33%的SSR引物在芸薹属近缘种间具有丰富的多态性.为了提高标记的通用性，可对进行番茄和马铃薯全基因组序列比对，在保守位点发展标记，并适当引入简并碱基，从而实现1套引物在不同茄科作物间通用.

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【责任编辑霍 欢】

Transferability of tomato SSR markers to eggplants and other Solanaceous vegetables

WANG Guoping1，NIU Yu1，2，WANGWenyi1，YUE Suju3，LIN Jianrong4
（1 College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2 Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737，China；3 College of Life Sciences，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；4 Guangzhou Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510308，China）

【Objective】Tomato genome was sequenced and a large number of SSR markers could be obtained.Cross-species amplification of tomato SSR markers will be an economic method to add up the number of robust SSR markers in eggplant and Solanaceous vegetables.【Method】This study tested a large set of tomato SSR markers on eggplant and other Solanaceous vegetables by close relative species transfermethod.【Result and conclusion】887 out of 1046 tested tomato SSR markers could successfully amplify on eggplants，but only 425 produced very similar bands on tomatoes and eggplants，giving a transfer rate of 40.6%.EST-SSRmarkerswere found to bemore transferable than genomic SSRmarkers（54.5 and 38.9%respectively）.414 transferable SSR markersweremapped electronically onto tomato genome and their distribution on individual chromosomes highly varied.93 SSRmarkers showed polymor-phism on two eggplant parents used for genetic map construction.When testing 425 cross-species SSR markers on potatoes，peppers and lycium，the transferability rates were 96.2%，78.1%and 54.1%，respectively.

tomato；eggplant；SSR markers；transferability；Solanaceous vegetables

S641.2

A

1001-411X（2014）04-0056-05

2013-04-10优先出版时间：2014-06-03

优先出版网址：http:∥www.cnki.net／kcms／doi／10.7671／j.issn.1001-411X.2014.04.011.html

汪国平（1967—），男，副教授，博士，E-mail:gpwang＠scau.edu.cn

科技部国际合作项目（2010DFA32190）；国家自然科学基金（31171957，30771472）；广东省科技厅国际合作项目（2009B050100001，2011B050100013）；广州市科技支撑计划项目（2010Z1-E381）

汪国平，牛 玉，汪文毅，等.番茄SSR标记在茄子及其他茄科作物上的通用性分析［J］.华南农业大学学报，2014，35（4）：56-60.