miR-126对Hela细胞增殖的影响及其与CRKL的靶向关系

邱 刚，房保栓，魏 强，苑晓烨，吴大勇，辛国宏

1)河北省人民医院肿瘤二科 石家庄 050051 2)河北省人民医院核医学科 石家庄 050051 3)河北省人民医院老年病二科 石家庄 050051 4)河北省人民医院肿瘤三科 石家庄 050051

miR-126对Hela细胞增殖的影响及其与CRKL的靶向关系

邱 刚1)，房保栓1)，魏 强2)，苑晓烨3)，吴大勇2)，辛国宏4)#

1)河北省人民医院肿瘤二科 石家庄 050051 2)河北省人民医院核医学科 石家庄 050051 3)河北省人民医院老年病二科 石家庄 050051 4)河北省人民医院肿瘤三科 石家庄 050051

#通讯作者，男，1975年9月生，博士，主治医师，研究方向：肿瘤的发病机制及临床诊疗，E-mail：xinguohong@126.com

宫颈癌；miR-126；CRKL；增殖

目的：探讨miR-126对宫颈癌Hela细胞增殖活性的影响及其与CRKL的靶向关系。方法构建miR-126、CRKL野生型(CRKL-WT)和突变型(CRKL-MT)真核表达载体pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT。采用实时荧光定量PCR法检测未转染、pcDNATM6.2-GW转染和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126转染Hela细胞miR-126和CRKL mRNA的表达水平，应用MTT法检测细胞的增殖活性，Western blot法检测细胞CRKL蛋白的表达水平。将细胞分别共转染pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-MT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-MT，采用双荧光素酶报告系统检测细胞荧光素酶活性。结果与pcDNATM6.2-GW转染组细胞比较，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组细胞miR-126 mRNA过表达(t=545.891,P<0.05)，CRKL mRNA和蛋白表达水平均降低(t=135.755、180.661,P<0.05)，同时细胞的增殖活性亦降低(P<0.05)；共转染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT的Hela细胞荧光素酶活性下调(Fpre-miR-126=55.627，FCRKL=61.843，F交互=76.203，P均<0.001)。结论miR-126的过表达能够显著抑制Hela细胞的增殖，并且与CRKL具有良好的靶向关系。

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳癌[1]。宫颈癌早期可考虑手术治疗，晚期多以放疗为主，病死率较高，预后较差。目前对于宫颈癌发生的分子机制仍不甚清楚。miRNAs作为一类重要的小分子非编码RNA，主要通过作用于其下游靶基因mRNA的3’UTR区，抑制或降解靶基因mRNA的表达，从而参与多种基因的转录后调控。目前研究[2]已经证实miRNAs的异常表达对于多数人类肿瘤的发生具有重要的调控作用。miR-126作为抑癌基因，其异常表达能够引起多种人类恶性肿瘤的发生，与癌细胞的迁移、侵袭和增殖关系密切[3-7]，但有关miR-126在宫颈癌中的相关研究甚少。作者采用生物信息学的方法发现miR-126与CRKL(V-crk avian sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like)存在良好的碱基互补关系，推测二者之间可能存在靶向关系。作者通过构建miR-126、CRKL野生型和突变型真核表达载体，转染人类宫颈癌Hela细胞株，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、MTT法、双荧光素酶报告基因检测及Western blot等方法观察转染细胞增殖能力的变化，验证miR-126与CRKL的关系，探讨miR-126对Hela细胞CRKL的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1材料Hela细胞株、pmirGLO和pcDNATM6.2-GW真核表达载体、大肠杆菌DH5α均由该研究室保存。Hela细胞于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养。限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ和XhoⅠ，T4 DNA连接酶，逆转录试剂盒(PrimeScript®RT)和SYBR(Premix Ex TaqTMⅡ)均购自TaKaRa公司。质粒抽提及凝胶回收试剂盒购自天根生化(北京)科技公司。LipofectamineTM2000转染试剂和Trizol购自Invitrogen公司。MTT、DMSO购自Sigma 公司。双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司。10×Annealing Buffer、蛋白裂解液RIPA和SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自碧云天生物技术公司。PVDF膜和蛋白发光液购自Millipore公司。DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Hyclone公司。小鼠抗人CRKL抗体(#3182)购自Cell Signaling公司，小鼠抗人β-actin抗体购自Santa Cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2miR-126、CRKL野生型和突变型基因真核表达载体的构建从miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/)中检索到hsa-miR-126的前体颈环序列pre-miR-126(5’-CGCUGGCGACGGGACAUUAU UACUUUUGGUACGCGCUGUGACACUUCAAACUCGU ACCGUGAGUAAUAAUGCGCCGUCCACGGCA-3’)，在该序列及其互补序列两端加入Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位点。在mirecords网站(http：//mirecords.biolead.org)根据碱基互补原则筛选成熟miR-126的候选靶基因CRKL序列(5’-GUAACUGCUGUCG GUGUGG-3’)，并在该序列及其互补序列两端加入SacⅠ和XhoⅠ酶切位点。同时在miR-126与CRKL互补的种子区域设计突变位点(图1)。所有序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的单链序列经10×Annealing Buffer 95 ℃退火4 min至双链。对pcDNATM6.2-GW进行Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切，对pmirGLO进行SacⅠ和XhoⅠ双酶切；采用T4 DNA 连接酶将pre-miR-126与pcDNATM6.2-GW酶切后的大片段重组，将CRKL野生型(CRKL-WT)和CRKL突变型(CRKL-MT)双链DNA分别与pmirGLO酶切后的大片段重组，16 ℃过夜连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，均匀涂布于含抗生素的LB平板上，37 ℃过夜培养。随机挑取阳性克隆置于LB培养液中，37 ℃摇菌过夜，12 h后提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，并进行NCBI BLAST系统比对分析。重组载体分别为pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT。

图1 miR-126与CRKL靶向预测互补关系及突变型设计图

1.3miR-126对Hela细胞CRKL表达影响的观察

1.3.1 细胞分组 将Hela细胞接种于6孔板中，每孔(2～6)×105个细胞，分3组培养，每组3个复孔。空白对照组：细胞不作处理，常规培养。转染pcDNATM6.2-GW和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组：按照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂说明书操作，分别转染相应载体。

1.3.2 细胞中miR-126和CRKL mRNA的检测 采用qRT-PCR法检测细胞中miR-126 mRNA 表达水平，用以评价重组载体的转染效率。miR-126逆转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCATTA-3’；PCR引物序列上游为5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’，下游为5’-TGCTTCGTACCGTGAGTAA-3’，以U6作为内参。同法检测细胞中CRKL mRNA 表达水平，CRKL PCR引物序列上游为5’-GTCTTT GCGAAAGCAATC-3’，下游为5’-GTATCTCGCCATG GCCTCAAG-3’，以β-actin作为内参。采用TaKaRa公司逆转录试剂盒和SYBR试剂盒进行逆转录反应和PCR，采用2-ΔΔCt计算miR-126和CRKL mRNA的表达水平。

1.3.3 细胞中CRKL 蛋白的检测 按照RIPA裂解液说明书操作提取细胞总蛋白，分光光度法测定蛋白浓度，配置100 g/L SDS-PAGE凝胶，凝胶上样量约为20 μg，80 V 30 min、100 V 1 h电泳，湿转法转膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加入小鼠抗人CRKL抗体(#3182)4 ℃孵育过夜，抗体稀释1 000倍，TBST洗膜，加二抗常温孵育1.5 h，TBST洗膜，蛋白发光液显影，以β-actin作为内参照，采用Image J分析条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.4miR-126对Hela细胞增殖影响的观察将Hela细胞接种于96孔板中，每孔约4×103个，分为3组，每组3个复孔，分别为空白对照组、pcDNATM6.2-GW组和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组，按1.3.1方法转染相应抗体，每4～6 h更换1次培养基，分别于37 ℃孵育24、48和72 h后，MTT法检测细胞增殖活性。

1.5miR-126对CRKL的靶向作用观察取对数期Hela细胞接种于96孔板中，每孔约4×103个，分为4组，每组3个复孔，分别共转染pcDNATM 6.2-GW和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW和pmirGLO-CRKL-MT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT、pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-MT。转染24 h后，根据双荧光素酶报告系统说明书操作，上机检测并计算荧光素酶活性。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0进行数据分析，pcDNATM6.2-GW组和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组细胞miR-126、CRKL mRNA和蛋白表达水平的比较采用两独立样本t检验，空白对照组、pcDNATM6.2-GW组和pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组细胞增殖活性的比较采用单因素方差分析，采用2×2析因设计的方差分析对miR-126和CRKL基因表达对Hela细胞荧光素酶活性的影响进行评价，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR-126与CRKL真核表达载体的鉴定重组质粒测序结果经NCBI BLAST系统比对，结果如图2所示，提示无碱基突变和丢失，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT重组载体均构建成功。

图2 miR-126与CRKL真核表达载体的测序结果

A：pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126；B：pmirGLO-CRKL-WT；C：pmirGLO-CRKL-MT。

2.2pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126转染对Hela细胞miR-126mRNA、CRKLmRNA和蛋白表达的影响与pcDNATM6.2-GW组比较，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组细胞miR-126表达水平升高，同时CRKL mRNA和蛋白表达水平降低(表1)，提示pre-miR-126在Hela细胞中具有较高的转染效率，并且可显著抑制CRKL的转录和蛋白表达。

表1 pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126转染对Hela细胞的转染效率及对CRKL mRNA和蛋白表达的影响

2.3pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126转染对Hela细胞增殖活性的影响pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126组细胞增殖活性显著低于pcDNATM6.2-GW组和空白对照组(表2)。

表2 3组细胞增殖活性测定结果

*:与空白对照组比较，P<0.05；#：与pcDNATM6.2-GW组比较，P<0.05。

2.4miR-126对Hela细胞CRKL的靶向作用pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126与pmirGLO-CRKL-WT共转染的Hela细胞荧光素酶活性明显降低(表3)。

表3 4组荧光素酶活性的比较

Fpre-miR-126=55.627，FCRKL=61.843，F交互=76.203，P均<0.001。

3 讨论

宫颈癌的发生及发展受到多种因素的影响，其中肿瘤相关基因的异常表达在其中发挥了重要的作用。miRNAs在宫颈癌的发生过程中可大致分为抑癌作用和致癌作用两大类。miR-99在宫颈癌中呈低表达，可以通过靶向调控TRIB2来抑制Hela细胞的增殖能力[8]；miR-203不仅能够通过下调VEGFA抑制宫颈癌细胞的生长，还可以抑制血管的生成[9]；而miR-224在宫颈癌中的表达显著增高，并与淋巴结转移、血管侵袭度等不良预后指征呈正相关[10]。miR-126的异常表达能够引起多种人类恶性肿瘤的发生。体外实验[4]发现miR-126可以通过靶向作用于CXCR4抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭。miR-126的表达下调与结肠癌的转移密切相关，在HCT116、SW620和HT-29多种结肠癌细胞中均观察到miR-126呈低表达，并且miR-126可以通过抑制RhoA/ROCK信号通路来调控上述细胞的增殖[5]。此外，miR-126不仅能够在恶性黑色素瘤中直接靶向作用于ADAM9和MMP7，抑制细胞的侵袭，还可以通过抑制骨髓间充质干细胞和炎性单核细胞的募集抑制癌细胞的转移[6-7]。CRKL属于衔接蛋白CRK家族成员之一，在多种肿瘤中表达，可能诱发肿瘤的发生。Cheung等[11]认为CRKL的过表达能够诱导非小细胞肺癌癌细胞的转化，并能够对表皮生长因子抑制剂产生抗性，加重病情的进展。CRKL可能通过上调Cyclin D1和Cyclin B1蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖[12]。Liu等[13]发现CRKL高表达与肝癌患者的不良预后密切相关。该研究中，作者在生物信息学的基础上，筛选出miR-126的候选靶基因CRKL，并成功构建了pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126、pmirGLO-CRKL-WT和pmirGLO-CRKL-MT真核表达载体；与空载体转染细胞比较，转染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126的Hela细胞miR-126过表达，CRKL mRNA和蛋白表达水平亦明显降低，同时细胞的增殖活性显著降低；双荧光素酶报告基因检测结果显示，共转染pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126和pmirGLO-CRKL-WT的Hela细胞荧光素酶活性降低。上述实验结果提示，miR-126能够显著抑制Hela细胞CRKL的表达，二者之间存在良好的靶向关系。miR-126可能通过靶向调控CRKL参与宫颈癌细胞增殖活性的调控。

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(2013-12-03收稿 责任编辑王 曼)

Effect of miR-126 on proliferation of human cervical carcinoma Hela cells and target relationship with CRKL

QIUGang1)，FANGBaoshuan1)，WEIQiang2)，YUANXiaoye3)，WUDayong2)，XINGuohong4)

1)SecondaryDepartmentofOncology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 2)DepatmentofNuclearMedicine，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 3)SecondaryDepartmentofGeriatrics，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051 4)ThirdDepartmentofOncology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051

cervical carcinoma；miR-126；CRKL；proliferation

Aim：To assess the effect of miR-126 on proliferation of human cervical carcinoma Hela cells and target relationship between miR-126 and CRKL.Methods：Recombinant plasmids of pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 targeted at miR-126，pmirGLO-CRKL-WT targeted at wide type CRKL gene and pmirGLO-CRKL-MT targeted at mutant type CRKL gene were constructed.qRT-PCR method was used to detect miR-126 and CRKL mRNA in cells transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 or empty vector，and cells without transfection.Western blot method was used to detect CRKL protein.MTT method was used to detect the proliferation.The cells were divided into 4 group，and co-transfected with pcDNATM6.2-GW and pmirGLO-CRKL-WT，pcDNATM6.2-GW and pmirGLO-CRKL-MT，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-WT，pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-MT，respectively，dual-luciferase assay system was used to detect the luciferase activity in cells.Results：Compared with those of cells transfected with empty vector，the expression of miR-126 mRNA in the cells transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 increased(t=545.891,P<0.05)，while CRKL mRNA and protein expression decreased(t=135.755,180.661,P<0.05)，and the proliferation activity decreased(P<0.05).Luciferase activities of the cells co-transfected with pcDNATM6.2-GW-pre-miR-126 and pmirGLO-CRKL-WT decreased as well(FmiR-126=55.627，FCRKL=61.843，Finteraction=76.203，P<0.001).Conclusion：Overexpression of miR-126 could suppress cell proliferation by targeting CRKL in Hela cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.05.034

R737.33