纳米传感器对卵巢癌患者呼气的分析研究

张 伟，石大友，陶 丽，花庆岭，杜瀛瀛，张 静，庄亚丽，刘 虎

纳米传感器对卵巢癌患者呼气的分析研究

张 伟1*，石大友1*，陶 丽2，花庆岭1，杜瀛瀛1，张 静3，庄亚丽3，刘 虎1

目的 探讨利用纳米传感器（亦称纳米鼻）气体识别技术筛查卵巢癌（OC）的可行性。方法 收集48例OC患者和48例健康对照者的呼气标本，利用纳米传感器对以上两组受试者呼气标本进行气体指纹图谱的分析，通过判别因子分析（DFA）模式进行鉴别区分。结果 OC患者和健康对照者之间达到良好的区分（89%的准确度）;早期OC患者与健康对照者之间达到75%的准确度。结论 纳米传感器呼气分析技术作为一种非侵入性的筛查方法，对于OC的早期诊断具有潜在的应用价值。

卵巢癌;气体指纹图谱;纳米传感器

*对本文具有同等贡献

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，因其发病隐匿以及缺乏有效的筛查工具，其病死率居妇科恶性肿瘤之首［1］。目前常规的OC肿瘤指标CA12-5以及超声、CT等辅助检查往往因为缺乏特异性、价格昂贵等不适合肿瘤的早期筛查。人体呼出的气体中含有200多种挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）。呼气分析通过分析人体呼气成分及含量的改变，从而反映出人体内病理生理的改变［2］，具有安全、快捷和无创等优点，已被应用于疾病的辅助诊断。本课题组前期利用气相色谱－质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）技术在肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和OC早期筛查方面均显示出良好的应用价值［3］。该研究拟采用纳米传感器技术对OC患者及健康对照者的呼气标本进行分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2012年3月～8月安徽医科大学第一附属医院、合肥市妇幼保健医院OC患者呼气样本48例，年龄30～70（51.38±11.32）岁，其中上皮来源OC 40例，恶性生殖细胞来源OC 2例以及交界性来源OC 6例;早期OC患者25例［（50.54±11.29）岁］，晚期OC患者22例［（53.18±11.80）岁］，1例分期不明。OC患者均为初诊初治，并随访术后病理证实，无肺部疾病以及肿瘤病史，无糖尿病高血压、自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎以及系统性红斑狼疮）。另选同期健康女性呼气样本48例（对照组），年龄36～69（49.59±9.02）岁。对照组为患者家属和医院职工，均经体检证实身体健康，均排除烟酒不良嗜好和妊娠可能。

1.2 主要仪器 3L-Tedlar®采样袋购自大连德霖气体包装有限公司;99.999%氮气购自合肥众仪有限公司;标准空气玻璃转子流量计购自常州双环热工仪表有限公司;包含9个传感器（6个金纳米传感器和3个碳纳米管传感器）的纳米传感器为以色列理工学院研制;ORBOTM420 Tenax®TA吸附管以及tube cutter购自美国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 气体采集 3L-Tedlar®采样袋使用前用99.999%的氮气清洗3次，以除去袋中的残留吸附物。嘱受试者夜间禁食，晨起在通风良好环境下深吸气后向采样袋中呼气，直至袋子吹满为止，同时采集患者周围的空气作为对照。

1.3.2 气体的吸附 利用tube cutter将Tenax®TA吸附管两端打开，再利用铁氟龙套管将吸附管两端分别与采样袋及标准空气玻璃转子流量计连接，将采样袋中的气体标本按照200 ml/min的流速浓缩到吸附管中，盖好两端密封盖。

1.3.3 气体分析 进行标本分析前，将纳米传感器的进样口真空处理5 min，再进行5 min的气体分析，再次进行真空处理，重复3～5次，以测试仪器的重复性。分析过程通过数据记录装置（2701型数字多用表）记录整个过程中传感器电阻的变化。记录的范围至少持续2个循环。整个系统操作过程由自定义的LabVIEW电脑程序控制。

1.4 统计学处理 本研究采用判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）作为统计模式识别算法。DFA的输出变量（即典型变量）通过在相互正交的维度得到第一典型变量（the first canonical variable，CV1），通过CV1值的统计处理从而有效地降低了多维的实验数据，最终将各组间的样本区分开来。本研究取各组70%的样本作为训练集建立DFA诊断模型，30%样本作为随机盲法测试集，验证DFA诊断模型。通过刀切法（亦称留一法）交叉验证真阳性（true positive，TP）、真阴性（true negative，TN）、假阳性（false positive，FP）和假阴性（false negative，FN）的预测数来评价分类是否成功。由于早期OC患者例数较少，因此对于早期OC与健康对照者之间DFA模型的验证采用K折交叉验证法。本研究使用MATLAB®（The MathWorks公司）软件进行模式识别和数据分类。

2 结果

2.1 OC与健康对照者间的鉴别 通过对48例OC患者与48例健康对照者的标本进行分析，取其中68份OC和健康对照者的呼气标本（各组70%的样本）建立 DFA模型，结果表明其准确度达到90%，敏感性、特异性分别为88%、91%，再对余下28例呼气标本（各组30%的样本）作为验证集，通过留一法交叉验证，结果显示对OC诊断的准确度达89%，敏感性和特异性分别为79%、100%。见图1、2 和表1。

图1 DFA模型用于卵巢癌和健康对照训练集样本和盲法验证集样本的分类

图2 训练集样本的受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic，ROC）

2.2 早期OC与健康对照者间的鉴别 对于25例早期OC和48例健康对照者间的鉴别中，通过采用DFA模型分析，鉴别的准确度达到82%，敏感性、特异性均为82%，由于早期OC例数较少，因此通过K折交叉进行验证，验证后结果显示，其准确性、灵敏度和特异度分别为75%、76%和75%。见图3、4和表1。

图3 DFA模型用于区分早期OC患者和健康对照者

图4 ROC用于区分早期OC患者和健康对照者

3 讨论

OC的5年生存率与分期密切相关，Ⅰ期OC 5年生存率约85%，而Ⅳ期仅为4%。故早期诊断是减少OC病死率和预后的关键所在。然而对于早期OC，往往无特异性症状，常规的OC肿瘤指标CA12-5特异性差，部分良性肿瘤及子宫内膜异位症等疾病均可出现阳性［4］，超声、CT等辅助检查往往因为缺乏特异性、价格昂贵等，不适合早期筛查。随着分子代谢组学的研究进展，新兴的代谢组学开辟了肿瘤早期诊断、疗效评价及预后判断的新思路。代谢组学是一种将图像识别方法和生物信息学结合起来的分析技术，用于检测体液或组织中的代谢产物并分析其变化规律。肿瘤的发生、发展伴随着机体代谢产物的变化，代谢组学能对肿瘤引起的机体代谢变化做出整体评价，筛选出有价值的生物标志物，用于肿瘤的早期诊断［5］。

表1 基于纳米传感器鉴别的DFA模型分类统计结果（%）

目前认为癌变过程常伴随有氧化应激的增强，产生过多的氧自由基，其作用于细胞膜上的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸导致VOCs的产生。呼气分析作为一种简便、快捷、无创的检测方法，通过对肿瘤异常代谢所产生的VOCs的含量和成分进行分析，从而达到对肿瘤的早期鉴别和诊断［6］。然而由于呼气中的VOCs浓度较低且成分复杂，因此对呼气检测的仪器要求很高。本课题组前期利用固相微萃取联合GC-MS技术，在肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌以及OC中均筛查出特异性肿瘤标志物［3］。本研究采用纳米传感器对OC患者及健康对照者呼气进行分析，相对于GC-MS，纳米传感器具有以下优势:不需要对样本进行除湿以及预富集处理;分析快速;检测的灵敏度高;分析数据前不必对数据进行选择就可以将各测试组区分开;并且不受性别、年龄及吸烟等因素影响［7］。其核心部分是金纳米颗粒的碳基感应器，当气体通过纳米颗粒传感器时，呼气中的颗粒就会积聚在碳层中，感应器膨胀推动金纳米颗粒相互接近，引起传感器电阻变化。而每种颗粒均具有独特的阻抗效应，每一个金纳米颗粒都可以反映一系列的VOCs，所有传感器的电阻变化均被同时记录下来，每种VOCs对应一个金纳米颗粒的电阻变化，最低检测范围为1～5 ppb，通过主成分分析对金纳米颗粒记录的电阻变化进行筛查，从而筛选出最能概括出检测标本最具特征的因素作为主成分，建立诊断模型，从而与其他研究对象鉴别区分开来。国内外有研究［8－10］报道利用纳米传感器技术对不同肿瘤之间的鉴别、胃良恶性溃疡的鉴别诊断以及不同转移潜能的肝癌细胞株的鉴别均取得了重要的结果。

本课题组前期利用GC-MS技术对OC患者进行呼气分析，最终筛查出苯乙烯和壬醛两种特异性标志物［3］，其两种物质的浓度在OC患者和健康对照者间差异有统计学意义，表明OC患者同健康对照者相比，其机体异常代谢后的呼气中存在有特异性的挥发性标志物，即两者呼出气体的主成分存在差异。因此，在前期的研究基础上，本研究采用纳米传感器技术，通过对受试者呼出气体的主成分进行分析，结果表明可以将OC患者与健康对照者区分开来，通过交叉验证后，其诊断的准确度达到89%，特异性达到100%。另外本研究还进一步对早期OC患者与健康志愿者的呼气进行分析，显示纳米传感器同样能够将二者很好的区分鉴别出来。本研究结果的意义在于:利用纳米传感器技术能够将早期OC患者从健康对照者中筛查出来，通过早期诊断、能够提高OC患者的生存率，降低其死亡率。因此对于有BRCA1和BRCA2基因突变、肥胖及肿瘤家族史的高危人群进行筛查，可能从中受益。然而，需要指出的是，本研究仅仅是小样本的探索性研究，对于OC患者尤其是早期患者的呼气分析，仍然需要大样本、多中心的实验研究进行验证。

（致谢:感谢以色列理工学院Hossam Haick教授和Haitham Amal博士的技术支持与帮助。）

［1］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）:69－90.

［2］Schnmutzhard J，Rieder J，Deibl M，et al.Piolt study:Volatile organic compounds as a diagnostic marker for head and neck tumors［J］.Head Neck，2008，30（6）:743－9.

［3］石大友，刘 虎，陶 丽，等.卵巢癌患者呼气中挥发性标志物的筛查［J］.安徽医科大学学报，2013，48（5）:499－501.

［4］万德森.临床肿瘤学［M］.北京:科学出版社，2010:466.

［5］熊 杰，赵维莅.代谢组学:肿瘤研究的新思路［J］.诊断学理论与实践，2012，11（6）:633－6.

［6］Miekisch W，Schubert J K，Noeldge-Schomburg G F.Diagnostic potential of breath analysis-focus on volatile organic compounds［J］.Clin Chim Acta，2004，347（1－2）:25－39.

［7］Peng G，Tisch U，Adams O，et al.Diagnosing lung cancer in exhaled breath using gold nanoparticles［J］.Nat Nanotechnol，2009，4（10）:669－73.

［8］Peng G，Hakim M，Haick H，et al.Detection of lung，breast，colorectal，and prostate cancers from exhaled breath using a single array of nanosensors［J］.Br J Cancer，2010，103（4）:542－51.

［9］Xu Z Q，Broza Y Y，Ionsecu R，et al.A nanomaterial-based breath test for distinguishing gastric cancer from benign gastric conditions［J］.Br J Cancer，2013，108（4）:941－50.

［10］Amal H，Ding L，Liu B B，et al.The scent fingerprint of hepatocarcinoma:in-vitrometastasis prediction with volatile organic compounds［J］.Int J Nanomedicine，2012，7:4135－ 46.

Analysis of ovarian cancer patients breath with nano-sensor technology

Zhang Wei1，Shi Dayou1，Tao Li2，et al
（1Dept of Oncology，2Dept of Gynecology and Obstetrics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveTo investigate the feasibility of odor prints for discriminating the ovarian cancer patients with nanomaterial-based sensors.MethodsAlveolar exhaled breath samples were collected from 96 volunteers，na-nose were used to discriminate the odor prints from 48 patients with ovarian cancer（OC）and 48 healthy controls by loading discriminant factor analysis（DFA）pattern recognition.ResultsThe blind DFA models showed:An excellent discrimination between the ovarian cancer patients and the healthy controls（89%accuracy）;early stage versus healthy controls showed 75%accuracy.ConclusionThe primary results can lead for a new non-invasive promising screening method for diagnoses early of OC of early stages and thus lowering the mortality of OC.

ovarian cancer;odor prints;nano-sensor

R 737.31

A

1000－1492（2014）05－0669－04

2014－02－25接收

安徽医科大学第一附属医院1肿瘤内科、2妇产科，合肥230022

3安徽医科大学妇幼保健临床学院（合肥市妇幼保健医院）产科，合肥 230061

张 伟，男，硕士研究生;

刘 虎，男，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail:drliuhu@gmail.com