六种食用油对铜绿微囊藻的抑制效应

张胜娟，夏文彤，杨晓辉，张庭廷

(安徽师范大学 生命科学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，安徽 芜湖 241000)



六种食用油对铜绿微囊藻的抑制效应

张胜娟1，夏文彤2，杨晓辉3，张庭廷4

(安徽师范大学 生命科学院，生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室，安徽 芜湖 241000)

通过对藻密度、抑制率等相关参数的测定，分别研究了金龙鱼食用油、大豆油、花生油等6种常见食用油对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa Kutz.)生长的影响.实验结果表明，金龙鱼食用油能有效抑制铜绿微囊藻的生长，并具有明显的剂量-效应关系，一定时间范围内的时间-效应关系.而3.0×105cells/ml的铜绿微囊藻，其半抑制浓度(EC50)最高可达4.18ml/L.

铜绿微囊藻；金龙鱼食用油；脂肪酸；抑藻效应

近年来，随着城市化和工业化的快速发展，大量生活和工业废水被排入江河湖泊，导致了淡水水体的富营养化，每至春夏之际，藻类水华频繁爆发，而水华藻类极易腐败，不仅能降低水体的含氧量，还能释放大量毒素，对人类淡水资源和水生生物的生存环境造成严重破坏[1].因此，如何有效控制水华藻类是维护人类生存环境的重大课题之一.淡水水华主要是蓝藻，而蓝藻中最常见的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)是蓝藻水华的主要元凶[2].铜绿微囊藻是一种单细胞藻类，属蓝藻门、微囊藻属，它所产生的藻毒素能够致癌，可严重威胁野生动植物及人类健康[3].

目前，利用化感物质治理水华是水华治理的主要研究方向.化感物质是水生植物生长过程中产生的次生代谢产物，一般能在自然环境中降解，不会在生态系统中长期积累[4]，故其生态安全性良好.迄今为止，发现的化感物质按照其化学结构可以分成5大类：脂肪族、芳香族、含氧杂环化合物、类萜和含氮化合物[5].其中脂肪酸作为一种重要化感物质，存在于许多植物的根茎叶中，在控制蓝藻水华过程中发挥着重要作用.Yasushi[6]等(2003)证明长链脂肪酸能够强烈抑制羊甲绿芽藻(Selenastrumcapricornutum)正常生长.Ikawa等[7](1984)发现C14-C18脂肪酸对绿藻(Chtorellapyrenoidosa)的生长也具有强烈的抑制作用；Zhang等[8](2008)从普生轮藻中分离出亚油酸、软脂酸和豆蔻酸，并发现它们均有不同程度的抑藻效应；同时还研究了17种不同碳链长度、不同饱和程度脂肪酸类物质的抑藻作用；发现各种脂肪酸均有一定的抑藻效应，抑藻活性与脂肪酸的结构有关；不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸的抑藻效应好，不饱和程度越高，抑藻效应越明显；饱和脂肪酸中碳链越短，化感抑藻效应越强.

为此，本实验所选用的材料是以脂肪酸为主要成分的食用油类，即金龙鱼食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油，这些油从天然植物中提取，对环境相对安全无毒，不会造成诸如化学试剂抑藻所带来的二次污染及生态毒性.实验研究对象为水华常见藻类——产毒铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)，拟通过研究分析上述6种常见食用油对产毒铜绿微囊藻生长的影响，寻找出抑藻效应强的食用油.为进一步开发生物除藻剂提供理论与实验依据.

1 材料与方法

1.1实验材料

实验中使用的6种食用油分别选定为：金龙鱼食用调和油(金龙鱼集团有限公司产品)、大豆油(中粮艾地盟粮油工业有限公司产品)、山茶油(金华市金山油脂有限公司产品)、压榨花生油(山东鲁花集团有限公司产品)、芝麻油(北京金亭建鑫食用油有限公司产品)、菜籽油(江苏红蜻蜓油脂有限责任公司产品)，以上材料均购于沃尔玛超市，所有食用油均为一级油.

实验藻种铜绿微囊藻FACHB-942(MicrocystisaeruginosaFACHB-942)由中国科学院武汉水生所淡水藻种库提供.

1.2实验仪器

Motic数码显微镜(德国Motic有限公司)；血球计数板(上海精密仪器仪表有限公司)；微孔过滤器，0.22μm微孔滤膜(上海兴亚净化材料厂)；注射器(上海中鸽注射器有限公司)；光照培养箱PGX-250B(宁波海曙赛福实验仪器厂)；架物托盘天平(上海斗门五金工具有限公司)；电子天平FA1104(上海精密科学仪器有限公司)；无菌操作台(新加坡ESCO有限公司)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂).

1.3藻种培养

在无菌条件下，向已经高温湿热灭菌的250ml锥形瓶内加入100ml的BG-11培养基[9]，加入铜绿微囊藻藻种，摇匀后放入光照培养箱内培养.培养条件为:温度24±2℃，光周期12L/12D，光照强度4000lx.每天振荡摇匀4-5次，实验前7天，对铜绿微囊藻进行扩大培养，每天加入新鲜培养基，使之处于对数生长期.

1.4抑藻实验

使用0.22μm微孔过滤器，分别对实验材料：金龙鱼食用油、大豆油、山茶油、花生油、芝麻油、菜籽油进行过滤以除去微生物，置于无菌环境中备用.在无菌条件下，取处于对数生长期的铜绿微囊藻，用已灭菌BG-11培养基稀释藻液，使得铜绿微囊藻液的藻密度为3.0×105cells/ml.

分别取出已稀释的藻液40ml加入100ml锥形瓶中，再加入各种待测试的食用油，使得各种油的最终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml/L.另外设置一个空白对照组，即只含相同藻密度的藻液；每组三个平行，置于1.3相同条件下进行培养，实验期为8天，每隔48h用血球计数板统计藻细胞数.

1.5对铜绿微囊藻生长影响的参数测定

1.5.1 藻密度 通过对藻细胞的计数来反映食用油对铜绿微囊藻生长的影响，每隔48h统计藻细胞1次，算出当天的藻细胞密度，连续计数8天.

1.5.2 抑制率与半抑制浓度 6种食用油对铜绿微囊藻的抑制百分率(Inhibition Ratio)公式为：IR(%)=(1-N/N0)×100%，其中：IR——抑制率；N——处理组的铜绿微囊藻的藻密度(cells/ml)；N0——对照组的铜绿微囊藻的藻密度(cells/ml)；将各浸提液的浓度及杀藻剂的用量与相应处理组生长抑制率做一元线性回归，求出半抑制浓度EC50(ml/L).

1.5.3 比增长率 铜绿微囊藻的比增长率的计算公式：μ=Ln(Xn/X=(n-1)/(tn-tn-1)，其中μ为比增长率；Xn、Xn-1分别为当天和2天前的铜绿微囊藻的藻密度；tn、tn-1分别对应于Xn、Xn-1的培养时间.

1.6统计方法

数据采用Excel2003软件和SPSS13.0软件处理，相关统计分析采用单因素方差分析，P<0.05表示有显著性差异；P<0.01表示有极显著性差异.

2 结果与分析

2.16种食用油对铜绿微囊藻生长的影响

图1显示的是6种食用油对铜绿微囊藻藻密度的影响.各处理组在2d内变化不大，从4d后开始表现出不同的变化趋势.金龙鱼食用油处理组从0.2ml/L—8.0ml/L，每个处理组的藻细胞生长曲线均低于同期对照组生长曲线，随处理时间增加，藻密度和同期对照组差距越大；观察各浓度的处理组藻密度变化情况，可发现浓度越高，藻细胞密度越低；而其他5种食用油处理组各组生长曲线与同期对照组相比较，差距并不明显，甚至有些浓度处理组的藻密度还高于对照组；这可能是因为这5种食用油对铜绿微囊藻并没有明显的抑制作用；综合比较6种食用油对铜绿微囊藻生长的影响，可以发现金龙鱼食用油对铜绿微囊藻有较明显的抑制作用，且浓度与抑制效果正相关.

◇:ck,□:0.5ml/L,△:1.0ml/L,×:2.0ml/L,○:4.0ml/L,+:8.0ml/L,

图1 金龙鱼食用油(A)、大豆油(B)、山茶油(C)、花生油(D)、芝麻油(E)、菜籽油(F)对铜绿微囊藻藻细胞密度的影响
Fig 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish(A)、soybean oil(B)、camellia oil(C)、peanut oil(D)、sesame oil(E)、rapeseed oil(F)on algae cell density of M.aeruginosa.

2.2金龙鱼食用油对铜绿微囊藻比增长率的影响

表1显示的是金龙鱼食用油对铜绿微囊藻比增长率的影响，与同期对照组比较，金龙鱼食用油的各处理组比增长率均低于同期对照组，随着处理时间延长，比增长率较对照组越低，在第8天8.0ml/L处理组出现了负增长.说明金龙鱼食用油能明显抑制铜绿微囊藻藻细胞的分裂和生长，浓度越高抑制效果越明显.

表1 金龙鱼食用油对铜绿微囊藻比增长率的影响Table 1 The effect of the edible oil of Golden dragon fish on specific growth rate of M.aeruginosa

*与同期对照组比较，P<0.05；**与同期对照组比较，P<0.01

2.3金龙鱼食用油对铜绿微囊藻生长的抑制率

表2显示,金龙鱼食用油各处理组随处理时间的增加，抑制率明显升高，比较同期各处理组的抑制率，还可发现浓度越高，抑制率越高，8.0ml/L处理组在第8天抑制率达70%左右，说明金龙鱼食用油对铜绿微囊藻有明显的抑制作用，且浓度与抑制率正相关,说明金龙鱼食用油能明显抑制铜绿微囊藻的正常生长.

表2 金龙鱼食用油对铜绿微囊藻的抑制率(%)Table 2 The inhibition ratio of the edible oil of Golden dragon fish on M.aeruginosa(%)

2.4金龙鱼食用油抑制铜绿微囊藻生长的半抑制浓度

EC50按照第8天计算，由于只有金龙鱼食用油对铜绿微囊藻的抑制率达到了50%以上，而其他5种食用油的抑制率并没有达到50%，所以只计算金龙鱼食用油的半抑制浓度，计算结果为4.18ml/L.

3 讨论

脂肪酸是一类重要的化感物质，有很强的抑藻作用[11-12].但本研究所用的原料是6种食用油，由于食用油均为饱和或不饱和脂肪酸所形成的甘油三酯，相对来说，游离的脂肪酸含量较低，其抑藻效果远不如游离脂肪酸的解释可能是脂肪酸中的主要官能团——羧基形成了酯键，使其化学性质发生了改变，因此，本研究所得结果可为是利用脂肪酸还是利用其形成的酯类化合物进行抑藻提供理论参考.而在6种食用油中，其它5种食用油均为单一油类，只有金龙鱼食用调和油是多种油的复合制剂，相对来说，其成分更多样化，而且其脂质中各种饱和程度不同的脂肪酸比例为饱和脂肪酸：单不饱和脂肪酸：多不饱和脂肪酸是111，因此在对铜绿微囊藻的抑制作用中，可能起到协同抑藻的效果，这一推测与张庭廷等[12]的研究结果相似.

此外，6种食用油均是从相应植物体提取出来的含脂肪酸的脂类物质，将它们加入培养基之后，这种培养基物理性质的改变，特别是其粘滞性对微囊藻的生长基本不会产生多大影响(加入食用油的量较小)，而真正的影响可能来源于食用油中的脂肪酸对藻细胞产生的一系列连锁反应.

关于脂肪酸的抑藻机理也有一些报道.张庭廷等[11]认为脂肪酸通过自由基的链锁反应，引起藻细胞膜脂质过氧化，导致MDA的积累，大分子核酸或蛋白质受到损伤，细胞膜通透性增加，叶绿素a合成减少，从而抑制藻细胞的生长，最终导致藻细胞破裂死亡.Wu等[13]认为脂肪酸改变藻细胞膜结构，造成K+外泄，诱发了对藻类的抑制效应.Sokolov等[14]认为脂肪酸改变了细胞膜超微结构或膜内的离子通道，从而引起细胞死亡.Agafonov等[15]报道长链C16-C22之间的饱和脂肪酸与Ca2+的亲和作用引发了抑藻效应.Igarashi等[16]认为脂肪酸通过Ca2+通道影响钙调蛋白依赖的蛋白激酶(CaM激酶)活性，进而影响磷酸酶活性，最终抑制藻类生长.

另外，食用油虽然能够有效抑制铜绿微囊藻的生长，但其效果却不是最理想的.油脂类在水体中的溶解性很低，即使加入量极少也会在水面出现漂浮现象，虽然是安全无毒害却也影响水体环境的美观.因此，以食用油抑制藻类生长在实际应用中将存在局限性.若想利用天然的油类抑藻可能要对其进行适当处理，在保持其天然特性的同时使其游离脂肪酸增加，从而增加其抑藻效能，这也是今后需要进一步探讨的内容.

然而，直接用食用油进行抑藻的研究还是首次，本研究为利用脂肪酸及其脂类抑藻提供了一些新的认识和实验依据.以食用油抑藻其优点是成本相对较低，纯天然，较人工合成的脂肪酸类可能会对环境更友好.脂肪酸类物质是植物体内重要的次生代谢产物，有着很好的生态安全性.因此利用脂肪酸类化感物质的特性进行抑藻，将对未来水华的治理有着重要意义.不足之处是耗损了粮食资源.同时，用脂肪酸抑藻时水体表面常有油状物漂浮，影响景观.如何才能减少食用油的使用，增加其溶解性，减少或消除其在水面的漂浮，提高其抑藻效果，这将是有待进一步解决的问题.

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TheInhibitionEffectsofSixKindsofEdibleOiltoMicrocystisAeruginosa

ZHANG Sheng-juan1, XIA Wen-tong2, YANG Xiao-hui3, ZHANG Ting-ting4

(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Through the determination of related parameters, such as algal density, inhibition rate and so on, this article respectively studied 6 kinds of common edible oil, for example, the golden dragon fish cooking oil, soybean oil, peanut oil, etc., in order to research their influence to the growth of microcystis aeruginosa Kutz. The experimental results show that the golden dragon fish oil can effectively inhibit the growth of Microcystis aeruginosa. Simultaneously, it also has obvious dose-effect relationship, time-effect relationship within a certain period of time. And the half inhibitory concentration (EC50) of 3.0×105cells/ml microcystin algae is up to 4.18ml/L.

microcystis aeruginosa; golden dragon fish oil; fatty acid; inhibitory effect on alga;

2014-05-07

国家自然科学基金(31170443).

张胜娟(1985-)，女，河南民权人，硕士研究生.通讯作者：张庭廷(1955-)，女，安徽东至人，教授，博士.

张胜娟，夏文彤，杨晓辉，等.六种食用油对铜绿微囊藻的抑制效应[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2014，37(6)：564-568.

X524

：A

：1001-2443(2014)06-0564-05