Ki-67在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

丛智荣，刘 红，徐小红，江 棋，沈 茜，曹永峰，倪静怡

(1.江苏省南通市肿瘤医院 内科，江苏 南通，226361; 2.南通大学附属医院 血液科，江苏 南通，226001)

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的一种非霍奇金淋巴瘤(non-NHL)，约占NHL的35%～40%。研究[1-2]表明，DLBCL是一组在临床表现、组织学形态、免疫表型、治疗反应及预后等方面具有较大异质性的血液系统恶性肿瘤。其发病机制尚不明确，多数学者认为细胞周期调控机制的失控在恶性肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。Ki-67是一种非组蛋白性核蛋白，其与肿瘤分化程度、浸润、转移及生存预后等关系密切，故Ki-67的表达可作为反映细胞增殖状态的标志，用来评估肿瘤生长增殖的情况[3]。本研究应用免疫组化法检测了60例DLBCL标本中Ki-67的表达情况，分析Ki-67与DLBCL的分型、IPI指数、疗效及预后之间的关系，以期为临床工作提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南通市肿瘤医院2008年3月—2011年2月病理活检或手术切除的DLBCL标本60例，设为观察组。所有患者均为初次发病，未接受过放化疗，未发现其他肿瘤或免疫缺陷病。患者的病例和随访资料均完整。其中，男45例，女15例，年龄15～85岁，平均(56±1.2)岁。根据世界卫生组织(WHO)淋巴瘤评价标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)及疾病进展(PD)，其中CR+PR组52例，SD+PD组8例；按照DLBCL的免疫表型分型及组织学参照2008年世界卫生组织(WHO)关于淋巴造血组织肿瘤分类标准，分为生发中心B细胞型(GCB)组14例，非生发中心B细胞型(non-GCB)组46例；根据IPI指数的高低将患者分为IPI<2组34例和IPI≥2组26例；根据Ki-67在观察组中表达的均值，分为Ki-67>均值组35例和Ki-67<均值组25例。另选取淋巴结反应性增生(RH)标本20例为对照组，其中男11例，女9例，年龄13～82岁，平均(55±2.2)岁。2组在性别、年龄等一般资料无显著统计学差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂：鼠抗人Ki-67单克隆抗体试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 检测方法：采用Max Vision免疫组织化学法，实验的步骤，严格按照说明书进行。选择2～3 μm石蜡切片，常规脱蜡和水化后，煮沸，修复抗原。室温下，用过氧化物酶封闭10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，滴加一抗，置于4 ℃冰箱内，过夜。PBS二次冲洗后，滴加二抗，室温下培养30 min。采用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，并使用1%盐酸酒精分化，返蓝。脱水、透明、中性树胶封固。Ki-67表达的阳性对照为已知的乳腺癌切片。

1.3 Ki-67阳性判定标准

Ki-67的阳性着色部位主要位于细胞核内。采用半定量法判断免疫组织化学结果，其阳性标准是细胞核内出现清晰地、颗粒状的棕黄色或黄褐色着色。阳性染色细胞≥75%为强阳性表达，≥50%为高表达，<50%为低表达。

1.4 观察指标

应用免疫组织化学检测2组Ki-67表达情况，比较Ki-67在GCB型和non-GCB型中的表达差异，并分析Ki-67与DLBCL分型、IPI、近期疗效、预后的关系。其中，IPI与预后相关的因素包括年龄、血清乳酸脱氢酶(LDH)、行为状况评分(PS)、Ann Arbor分期及淋巴结结外受侵数目。

2 结 果

2.1 2组Ki-67表达情况

Ki-67定位于细胞核，能很好地显示细胞增殖活性及核分裂现象，其阳性染色的主要表现为明显的黄褐色或棕黄色颗粒，呈灶性、散在性或弥漫性分布[3]。在观察组和对照组中，Ki-67的平均阳性表达率分别为(69.17±14.73)%和(40.50±14.95)%，差异具有统计学意义(t=7.509，P<0.0001)。且Ki-67在对照组中的表达部位大多在生发中心。

2.2 观察组各亚组间Ki-67表达比较

GCB型组和non-GCB型组、IPI<2组和IPI≥2组以及CR+PR组和SD+PD组中Ki-67的平均表达率经t检验，均有显著差异。见表1。

2.3 Cox模型多因素分析

观察组患者IPI指数的各项指标应用Cox模型进行多因素分析，结果显示: IPI指数中的各项指标均与患者预后有着密切的关系，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4 观察组Ki-67表达与预后的关系

Ki-67在观察组阳性表达的均值为69.17%，Kaplan-meier法及log rank检验结果显示，Ki-67>均值组和Ki-67<均值组的3年生存率分别为40.62%和82.14%，差异有显著统计学意义(P<0.05)。

表1 观察组各亚组间Ki-67的表达比较

表2 Cox模型多因素分析表

3 讨 论

DLBCL是一种异质性极强的疾病,其发病机制复杂，其中包括了染色体易位、异常体细胞高频率突变、基因扩增、缺失和突变等方面。目前临床上应用免疫组织化学的方法检测Bcl-6、CD10、MUM1的表达情况，将DLBCL分为GCB型和non-GCB型，有研究[4-6]表明GCB型的预后明显较non-GCB好。Ki-67是G1、S、G2、M期细胞的标志蛋白，G0期则缺乏该蛋白，所以Ki-67的表达可作为判断肿瘤细胞增生活性的指标[7-8]。近年来，一些学者通过检测Ki-67来反映DLBCL的增殖活性，并研究其与DCBCL的生物学行为、疗效、预后的关系。

本研究比较了Ki-67在淋巴瘤组织及淋巴结反应性增生中的表达差异，结果显示观察组表达高于对照组，且Ki-67在细胞分裂的不同时相表达水平有所不同，在M期时Ki-67表达水平最高，因此Ki-67是肿瘤细胞高增殖活性的标志[9]，提示Ki-67的表达对两者的鉴别诊断具有一定的参考价值。

Ki-67的增殖指数的高低与很多肿瘤的浸润、分化程度、转移及预后密切相关，因此，Ki-67被广泛作为恶性肿瘤增殖状态的标记物之一[10-12]。本研究结果显示，DLBCL免疫类型与Ki-67的表达水平有关。在恶性程度相对较低的GCB型组中，Ki-67的表达水平较低，而在恶性程度相对较高的non-GCB型组中，Ki-67表达水平较高，且Ki-67在2组中的表达是有显著差异的(P<0.05)，提示DLBCL免疫类型与Ki-67的表达水平有相关性。

IPI包含年龄、血清乳酸脱氢酶、行为状况评分、Ann Arbor分期、淋巴结结外受侵数目[13]。在本研究中，对60例DLBCL患者的IPI指数各项指标应用Cox模型进行多因素分析，结果提示IPI指数的各项指标均与患者预后有着密切的关系，其差异具有统计学意义。Ki-67在IPI<2组和IPI≥2组中的表达具有显著差异，可以推测Ki-67的高表达预示着恶性肿瘤细胞增殖更快，更易出现浸润其他淋巴结及结外器官，导致患者有更加不良的预后。因此，Ki-67可作为评判患者预后的一项重要指标，是对IPI指数的重要补充，两者联合检测对预测患者的病情发展有重要意义。

本研究还证实了近期疗效与Ki-67表达水平相关，在CR+PR组中Ki-67表达水平高，在SD+PD组中表达水平较低。Ki-67的高表达，显示了肿瘤细胞的高增殖性，也显示了肿瘤的高侵袭性，高侵袭性的肿瘤往往对化疗的敏感性较高，近期疗效较好。多数研究[14-15]表明，Ki-67的表达水平与患者的预后相关，Ki-67表达水平越高，肿瘤细胞增殖越快，则患者的预后越差。本研究根据Ki-67表达的均值分为Ki-67>均值组和Ki-67<均值组，对2组的生存进行分析，结果显示Ki-67<均值组的3年生存率显著长于Ki-67>均值组，原因可能是Ki-67高表达患者对化疗药物相对比较敏感，近期疗效较好，但这类患者容易复发和浸润。

DLBCL无公认的肿瘤标志物来反映其预后

情况，但本研究结果表明Ki-67能够在一定程度上预测疾病的预后情况，可以用来作为DLBCL不良生物学行为、对化疗相对敏感性及预后不良的指标。

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