弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中NF-κB p65、P-gp、CYP3A4表达变化及意义

朱 斌，潘韶英，赵 红，丁志勇

(上海市第六人民医院南院奉贤区中心医院，上海 201499)

弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一种最常见的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其侵袭性强，病理特征具有高度异质性［1，2］。据统计，约 40%的 DLBCL患者可通过联合化疗实现完全缓解，但仍有＞50%的患者对化疗反应较差，尤其是因多药耐药(MDR)导致复发转移或进展，预后不佳［3］。MDR发生机制较为复杂，学者认为其主要与肿瘤细胞过度表达核转录因子-κB(NF-κB)、P-糖蛋白(P-gp)、细胞色素P4503A4(CYP3A4)等耐药相关基因及蛋白有关［4］。本研究观察了 DLBCL 组织中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择上海市奉贤区中心医院病理科2007年1月～2011年12月86例结内病变的DLBCL组织样本，临床资料齐全，获得随访。患者均经手术及组织病理学确诊，术前均未接受任何放射治疗或化学治疗。其中男49例，女37例;年龄25～76岁，中位年龄57岁。组织分型:中心母细胞变异型37例、免疫母细胞变异型29例，间变型20例。按照Ann Arbor分期标准，Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期33例。预后相关的淋巴瘤国际预后指数(IPI)［5］低危(0～2)49例，高危(3～5)37 例。选择同期我院手术切除的性别、年龄相匹配的30例反应增生性淋巴结患者的组织标本作为对照。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 采用免疫组化SP法。将标本用10%甲醛固定、石蜡包埋，制成4 μm厚切片;常规脱蜡、水化、0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)抗原热修复。兔抗人NF-κB p65单克隆抗体、鼠抗人CYP3A4单克隆抗体、鼠抗人P-gp单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物科技有限公司，采用试剂盒已知阳性组织作为阳性对照，以PBS代替一抗体作为阴性对照。NF-κB p65、P-gp、CYP3A4的判定标准:随机选择10个高倍镜视野(×400)计数1000个肿瘤细胞，肿瘤细胞胞质内呈棕黄色颗粒为阳性细胞。采用许良中等［6］的计分方法对阳性细胞百分数及染色程度进行计分，两项积分乘积≥2为阳性。

1.2.2 随访方法 对所有患者通过门诊或电话形式进行随访，随访日期从患者出院日期截至2013年12月30日或至患者死亡。随访内容包括患者的一般状况、生活质量及近期复查情况。

1.2.3 统计学方法 采用 SAS8.2统计软件。计数资料比较采用χ2检验，采用Spearman秩相关进行相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表达比较 DLBCL组织中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4阳性表达率分别为 62.8%、57.0%、33.7%，淋巴增生组织中分别为23.3%、20.0%、13.3%，P 均 ＜0.05。

2.2 DLBCL 组织中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表达与临床病理参数的关系 DLBCL组织中NF-κB p65表达与IPI、临床分期有关(P均＜0.05)，P-gp表达与结外病灶数、临床分期有关(P均 ＜0.05)，CYP3A4表达与IPI、临床分期有关(P均＜0.05)。见表1。

表1 DLBCL 组织中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表达与临床病理参数的关系(例)

2.3 DLBCL 组织中 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表达的关系 DLBCL组织中 NF-κB p65与 P-gp、CYP3A4 表达呈显著正相关(r=0.593、0.452，P 均＜0.05)，P-gp、CYP3A4 表达之间无显著相关性(r=0.155，P ＞0.05)。

2.4 NF-κB p65、P-gp、CYP3A4 表达与患者生存时间的关系 随访20～60个月，平均40个月。NF-κB p65、P-gp、CYP3A4阳性表达者2年总生存率分别为25.0%、36.7%、31.0%，均显著低于阴性表达者的68.8%、64.9%、68.4%，P 均 ＜0.05。

3 讨论

目前，DLBCL的发病机制尚不完全清楚，但普遍认为DLBCL的发生、发展是多步骤、异质性的过程，涉及多种遗传信息的异常，从而诱发各种信号通路的失活或异常激活，引起细胞周期、增殖、分化及凋亡的异常，最终促进DLBCL的发生与发展［7］。现已明确，诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用是抗癌药物的重要机制，而NF-κB是目前认为与细胞凋亡密切相关的生物因子，其中活化的NF-κB是肿瘤细胞发生、进展及耐药的关键因素［8，9］。但多种基因、信号途径和调控机制的参与使得单一基因或分子无法准确反映肿瘤细胞的异质性［10］。

本研究结果显示，DLBCL组织中NF-κB p65、P-gp及CYP3A4阳性表达率均高于淋巴增生组织，且其阳性率随DLBCL临床分期的增高而增高，提示这3个指标对于判断DLBCL的恶性程度、浸润及转移具有一定价值。本研究未发现NF-κB p65与结外病灶数相关，可能与DLBCL的异质性有关，也可能与本研究样本量较少有关。相关分析发现，DLBCL组织NF-κB p65、P-gp表达呈正相关，说明二者存在一定协同作用，共同参与肿瘤耐药的产生。Bentires-Alj等［11］研究指出，NF-κB 作为一种重要的 NF，调控MDR1等诸多基因的表达;抑制人结直肠腺癌HCT-15细胞中NF-κB的表达，可有效减少MDR1 mRNA、P-gP 表达。本研究中，NF-κB p65、CYP3A4表达呈正相关。大量研究证实，P-gp与CYP3A4存在广泛底物重叠，现已发现皮质醇、秋水仙碱、环孢素、尼卡地平、维拉帕米、依托泊苷、紫杉醇等均为P-gp和CYP3A4的共同底物。当药物排出减少时，细胞内药物蓄积引起CYP3A4酶的竞争性抑制，或P-gp抑制剂本身即为CYP3A4抑制剂。本研究未发现 P-gp与 CYP3A4的表达相关，与 Masahiko等［12］研究结果一致，可能与样本量较少有关。

目前认为，DLBCL预后与诸多因素有关，IPI被视为指导临床治疗及预后评估的重要参考指标，但因其所能反映的并非疾病的本质，且由于DLBCL是一种高度异质性的疾病，不同的病理亚型、发病机制也不相同，导致即使IPI相同的患者亦可造成截然不同的结局。因此，在IPI的基础上，与一些分子预后指标相结合，探索并建立一个高效的预后评价模式，为个体化治疗提供更多的理论基础，对于指导DLBCL治疗有极高的价值。随访发现，NF-κB p65、P-gp、CYP3A4阳性表达者2年总生存率均显著低于阴性表达者，说明三者阳性表达对DLBCL疾病过程具有负面作用，反之，阴性者具有生存优势。

综上所述，DLBCL组织中 NF-κB p65、P-gp和CYP3A4高表达，其一定程度上反映了DLBCL的生物学异质性、临床分期及对治疗的反应，可能成为抑制DLBCL生长、转移的生物靶点。

［1］Rossi D，Gaidano G.Molecular heterogeneity of diffuse large B-cell lymphoma:implications for disease management and prognosis［J］.Hematology，2002，7(4):239-252.

［2］Seerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al.World health organization classification of tumors.WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues［M］.Lyon:IARC Press，2008:112-134.

［3］Ding ZY，Yang L，Xie XD，et al.Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(11):1697-1707.

［4］Valera ET，Scrideli CA，Queiroz RGP，et al.MDR-1，MRP，LRP expression in childhood acute lymphomablasticleukemia［J］.Sao Paulo Med J，2004，122(4):166-171.

［5］Finn WG，Kroft SH.New classifications for non-Hodgkin's lymphoma［J］.Cancer Treat Res，1999(99):1-26.

［6］许良中，杨文涛.免疫组化反应结果的判定［J］.中国癌症杂志，1996，6(4):229-231.

［7］青晓艳，姚文秀，徐义全.弥漫大B细胞淋巴瘤的研究现状及展望［J］.中华临床医师杂志(电子版)，2012，6(4):983-985.

［8］Karin M，Cao Y，Greten FR，et al.NF-kappa B in cancer:from innocent bystander to major culprit［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(4):301-310.

［9］郭琰，顾康生.侵袭性T细胞非霍奇金淋巴瘤的耐药机制［J］.国际肿瘤学杂志，2011，38(9):707-709.

［10］Baud V，Karin M.Is NF-κB a good target for cancer therapy Hopes and pitfalls［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8(1):33-40.

［11］Bentires-Alj M，Barbu V，Fillet M，et al.NF-kappa B transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells［J］.Oncogene，2003，22(1):90-97.

［12］Masahiko O，Yoshihiro I，Hiroko F，et al.Immunohistochemical expression of multidrug resistance proteins as a predictor of poor response to chemotherapy and prognosis in patients with nodal diffuse large B-cell lymphoma［J］.Oncology，2005，68(4-6):422.