化学品生物降解影响因素研究进展

林春骏，刘济宁，周林军，石利利*，冯洁

1.南京信息工程大学环境科学与工程学院，江苏 南京 210044 2.环境保护部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042

化学品的大量生产、使用带来很多环境污染，已对生态系统及人类健康产生潜在的风险[1]。人体持续地暴露在这些物质下，即使极低浓度，也可能对自身健康产生巨大危害[2]。

生物降解是有机化学品在环境中的主要去除途径之一。土壤和水体中的微生物(如细菌和真菌)在其生长过程中会以有机化学物质作为碳源，消耗基质中的化学物质使其浓度逐渐降低。

目前各国的新化学物质登记都要求提交化学物质的生物降解性数据，评价其在环境中的持久性。化学品的生物降解性测试普遍采用经济合作与发展组织(OECD)的《化学品测试导则》中的快速生物降解(301)、固有生物降解(302)以及模拟生物降解方法(303)[3]。但是由于众多的测试方法测试条件不同，导致化学品的生物降解过程多样、影响因素复杂，且降解机理尚未完全明了，难以对测试结果进行合理有效的解释。因此有必要对生物降解机理、生物降解过程、生物降解影响因素进行详细的研究，从而指导化学品生物降解测试工作。

在化学品生物降解过程中，降解途径(如生长代谢和共代谢)对化学品的生物降解性影响较大，此外微生物群落、温度、pH、溶解氧、基质浓度以及化学结构都会对化学品的生物降解性产生影响[4-10]。

笔者阐述了化学品降解过程中生长代谢、共代谢的原理和作用，同时详细分析了异养和自养微生物在化学品生物降解过程中的作用，以及各自降解酶对降解性的影响，以期为化学品的生物降解测试中化学品降解规律解释以及提高化学品固有生物降解性测试能力提供指导。

1 化学品在环境中的生物降解途径

生物降解是将大分子有机化合物转变成小分子化合物或矿化为二氧化碳、水的复杂过程。在一般生物降解过程中，微生物利用有机物作为细胞生长的主要底物(生长基质)，同时诱导酶进行同化作用，该过程一般称为生长代谢。

化学品在自然环境中浓度一般在ng/L级别[11]，很多化学品有毒或抑制微生物生长，微生物可能不利用化学品作为唯一碳源。在这种情况下，微生物可能利用其他物质或碳源，作为生长基质维持微生物的生长并诱导产生酶类，通过共代谢降解化学品，最终促进化学品的生物降解[12]。

化学品在自然界和污水处理厂(sewage treatment plant，STP)中，生长代谢和共代谢这2种降解方式是同时存在的，共同对化学品的去除起着决定性作用。

1.1 生长代谢降解方式

在化学品生长代谢过程中(图1)，微生物利用化学品作为唯一碳源以维持其生物量，同时产生有关的酶和辅酶对其进行氧化/还原。因此，如果化学品以微生物生长代谢的方式进行降解，则该化学品应该对微生物无毒或低毒，且具有足够高的浓度。

一些学者研究了化学品生长代谢降解途径。如Murdoch等[13]研究发现，菌株SphingomonasIbu-2能够将布洛芬(ibuprofen)作为唯一碳源，以生长代谢方式降解。此外，Iasur-Kruh等[14]使用富雌激素降解菌(EDB)的菌株NovosphingobiumJEM-1对雌二醇(EstradiolE2)进行降解试验，发现该菌株能够通过生长代谢方式直接降解高浓度的E2(50 mg/L)。其他研究[13-15]发现，以生长代谢方式降解化学品的微生物只有异养细菌，没有发现自养微生物。

1.2 共代谢降解方式

20世纪50年代，在含氯溶剂、芳香族化合物和石油烃的生物降解试验中首次发现了共代谢现象[16]。图2显示了化学品的共代谢降解方式。许多化学品是有毒的或抑制微生物生长，且该类化学品通常在环境中含量很低。这2个特点使得化学品很难进入微生物细胞进行分解代谢和合成代谢，因此，化学品必须在生长基质或其他可利用的化合物的共同存在下才能进行降解。

进一步研究发现，共代谢能将一些难降解化学品转化为易降解中间产物[17]，但是最终降解产物可能比母体化合物的毒性更强，导致微生物不能进一步降解。Haiss等[18]研究发现，泛影葡胺(diatrizoate)是3,5-二氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的好氧生物降解产物，该降解产物具有很强的毒性，不能被常见细菌降解。同样，Groning等[19]研究发现，双氯芬酸(diclofenac)很容易被河流沉积物中微生物降解，形成中间产物对苯醌亚胺，但是该中间产物具有毒性，也无法继续降解。

化学品的共代谢降解过程中发现自养微生物(自养氨氧化菌)的参与，该菌的非特异性酶——氨单加氧酶(AMO)可以氧化大量有机污染物[20]。这主要是因为自养氧化菌能够利用无机碳和氨作为其生长的能量来源，诱导产生AMO和辅酶因子(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD和烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸 NADH)对化学品进行降解[21]。对于异养微生物，降解过程可能为共代谢和/或生长代谢，具体取决于化学品的浓度和其对微生物的毒性[22]。

2 环境条件和化学结构对降解率的影响

化学品的生物降解过程中受到许多非生物因素和生物因素的影响，如温度、pH、氧含量、生物利用度、生长基质、理化性质、分子结构和毒性等。这些条件可以限制或刺激微生物的生长，影响微生物的生物降解性。在STP中已经发现化学品的生物降解性存在显著差异。

2.1 温度影响

温度会直接影响微生物的活性。微生物需要在合适的温度范围内才能生长，如氨氧化菌(AOB)可以在低温下生长[23]，而氨氧化古菌(AOA)在4～25 ℃生长缓慢[24]。

为了研究温度对AOB和AOA的影响，Wu等[24]研究了AOB和AOA中的amoA因子的丰度变化，发现该因子能够通过编码AMO中的A亚单元，氧化氨和各种化学品。经过4周的培养发现，在4 ℃时AOB和AOA的amoA因子相对丰度较低，这可能是在低温下DNA分解、细胞死亡加剧，生长速率减缓导致的。在37 ℃时，2种微生物中amoA因子丰度发生显著增加。

Suarez等[25]研究发现，在16～26 ℃内E2和EE2降解结果无显著差异，表明在正常温度范围内，温度对化学品降解影响差异不显著。

2.2 pH影响

pH可以影响微生物的生理活性及化学品的溶解度。pH大于10或小于3时会抑制微生物生长，pH也会影响体系中真菌和细菌的比例。Bothe等[26]研究了土壤中的pH对真菌和细菌生长的影响，发现细菌在酸性土壤中(pH为4.5)生物量减少了5倍，而真菌却增长了5倍，表明细菌在酸性环境中竞争力减弱，不适宜生长，而真菌能够适应酸性环境，快速增长。

pH能够改变化学品的离子态和非离子态的比例，离子态部分易溶于水，非离子态部分易吸附于污泥，导致生物可利用性有所差异，最终影响生物降解性[27]。Urase等[28]研究证实，酸性受试物如布洛芬和酮洛芬(ketoprofen)的降解受pH影响明显，pH越低，降解率越高。如异丁苯丙酸(ibuprofen)在pH<6时降解率能超过90%，酮洛芬在pH<5时降解率也能达到70%。而非电离化学品如异丙安替比林(propyphenazone)、卡马西平(carbamazepine)的降解率比较恒定，与溶液的pH无关。

2.3 溶解氧的影响

水中的溶解氧(DO)浓度高低，会直接影响微生物的活性和种类，决定微生物的呼吸类型：厌氧、缺氧和好氧呼吸，从而直接影响微生物对化学品的降解能力。何起利等[29]模拟了湿地环境，研究发现DO与基质中细菌、真菌等微生物数量和多酚氧化酶、过氧化氢酶等酶存在显著的正相关关系，DO浓度直接影响自然环境中污染物的降解能力。Czajka等[23,30]分别在有氧条件下和厌氧条件下对雌激素(17α-炔雌醇[EE2]和17β-雌二醇[E2])的生物降解性进行研究，发现EE2在厌氧条件下未观察到生物降解，而在好氧测试中E2和EE2表现出了生物降解性。

2.4 化学结构的影响

化学结构直接决定化学品的降解性。Tran等[7]利用富硝化菌对10种化学品进行生物降解试验，结果表明，分子结构含有一个氯原子及以上的化学品，如氯贝酸(clofibric acid)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(dichloprop)降解率很低。

总结化学品的结构和降解性的关系，有以下规律：1)具有吸电子性基团(—SO3，—NO2，—Br，—Cl)的物质比推电子基团(—H，—NH2，—OCH3，—CH3，—COOH，—OH)的物质难降解，吸电子基团降低了氧化酶的亲电攻击性，导致生物利用度降低；2)取代基多的物质比取代基少的物质难降解，这主要是位阻效应也使生物利用度有所差别；3)饱和度高的物质稳定性更高，比饱和度低的物质难降解；4)短链烃比长链烃难降解，主要是因为长链烃的分子键更易断裂。

3 微生物及其酶的影响

化学品降解率受微生物影响显著，异养生物比自养硝化生物更易降解化学品[31]。笔者主要讨论自养氨氧菌和异养细菌、异养真菌和相关代谢酶对生物降解的作用。

3.1 自养氨氧化菌与硝化作用

环境中的氨主要由AOA和AOB氧化。AOA的amoA基因相对丰度直接影响STP的氨氧化速率，而AOB的amoA基因和氨氧化速率之间没有显著相关性[10]。因此，AOA的amoA基因在STP的氨氧化过程中有着重要作用[34]。

许多有毒的和难降解化学品，如卤代烃可通过硝化作用被有效地降解[35]。Helbling等[10]研究发现，AOB和AOA可以在氨存在的条件下，以其作为生长底物诱导产生AMO酶并提供还原剂来共代谢降解该类化学品。

3.2 氨单加氧酶共代谢作用

自养氨氧化菌对氨的氧化过程中需要AMO及羟胺氧化还原酶(HAO)2种关键酶。AMO催化氨氧化成羟胺(NH2OH)。HAO进一步将NH2OH氧化为亚硝酸盐。AMO能够氧化多种化学品如烷烃、烯烃和卤代烃类化学品[36]。AMO是由A，B和C 3个亚基组成(也称AMO-A、AMO-B和AMO-C)，这3个亚基分别由amo操纵子amoA、amoB和amoC编码[37]。

Yi等[17]发现了在一定范围内氨氧化速率和EE2降解率之间呈线性关系：当氨氧化速率从0.3 mmol/(g·h)(以VSS计，下同)增加到5.1 mmol/(g·h)时，EE2的降解率从1.1 μmol/(g·h)提高到4.1 μmol/(g·h)。Helbling等[10]发现，AMO能够显著促进化学品的生物降解，且氨氧化率和化学品降解率仅与AOA的amoA基因有关。这意味着AOB和AOA产生AMO酶在化学品的共代谢降解中有着关键作用，但是具体功能尚未阐明。因此，需要进一步研究共代谢反应中AOA和AOB的AMO功能，以及其他AMO亚基(如AMO-B和AMO-C)在化学品生物降解中的作用。

3.3 异养细菌的作用

为了了解自养氨氧化菌和异养细菌对化学品生物降解性的影响，可使用烯丙基硫脲(ATU)作为AMO抑制剂，抑制AOB氨氧化酶活性。Tran等[7]发现在ATU(10 mg/L)存在下，布洛芬和其他几个化学品仍然发生了降解，这表明在没有自养硝化作用的情况下，这些化学品仍然能被异养微生物降解。同样，Rol等[39]也发现在AMO抑制剂存在下，双酚A和布洛芬都被完全降解。而只有自养氨氧化细菌(Nitrosomonaseuropea)时，布洛芬不能被降解，异养细菌在化学品的生物降解中也发挥重要作用。

Khunjar等[21]研究了AOB和异养微生物在EE2和甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim, TMP)生物降解中的作用，发现AOB可降解EE2但不能降解TMP，而异养微生物不但可以矿化EE2，而且可以转化TMP，降解AOB产生的EE2衍生物。同时，还发现AOB和异养微生物可协同促进EE2降解。

3.4 异养真菌胞外木质素酶的作用

白腐真菌显示出与好氧菌明显不同的代谢途径，其底物特异性低，氧化能力强，可降解如卤代芳烃、多环芳烃、农药和工业废物等多种持久性有机污染物[40]。

白腐真菌主要依靠细胞外木质素降解酶(氧化酶和过氧化物酶)起作用，这些酶包括木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。这些降解酶对底物特异性较低，对化学品具有广谱性[41]。此外，白腐真菌还能分泌低分子量调节物，进一步扩宽氧化化学品的范围。很多学者使用胞外木质素降解酶对化学品进行了降解性研究。漆酶可以很明显地降解双酚A、三氯生和E1等酚醛类化学品[42]。一些非酚醛类化学品(如双氯芬酸和吲哚美辛)也可以被漆酶降解[43]。其他木质素降解酶(MnP和LiP)也可以降解化学品，但是MnP和LiP在自然条件下并不稳定[41]。

4 化学品生物降解性促进方法

4.1 添加生长基质

共代谢过程能够提高化学品的生物降解性，在共代谢过程中相关降解酶的数量取决于生长基质的浓度，为了提高降解化学品微生物共代谢作用，必须提供功能微生物群充足的生长基质。生活污水中生长基质含量很高，这也是很多工业废水必须要和生活污水合并处理的原因。

4.2 控制微生物群落结构

化学品的生物降解有自养微生物的共代谢降解、异养微生物的共代谢和/或生长代谢降解。典型的AOA可以通过非特异性酶AMO共代谢降解化学品，而异养微生物也能够通过他们的各种加氧酶降解多种化学品。由于自养和异养微生物产生酶的差异，化学品的降解率也不同，通过合理控制微生物的群落结构可以促进化学品的生物降解性。

4.3 真菌漆酶和加氧酶的组合

白腐真菌的胞外漆酶具有较低的底物专一性和降解酚类化学品的能力。在没有其他介质参与下，漆酶很难降解芳香族化合物或非酚结构的化学品。细菌加氧酶能够羟基化许多芳香族化合物和非酚结构的化学品，但是细菌很难降解羟基化的化学品，且羟基化的化学品往往会抑制细菌活性，而真菌漆酶容易降解细菌羟基化的副产物(苯酚基)。因此，研究设计真菌漆酶和细菌混合培养方法对促进化学品的生物降解性也具有重要意义。

5 研究展望

与快速生物降解性测试不同，固有生物降解测试用于评价化学品具有的最大生物降解能力。目前OECD化学品固有生物降解性测试方法中，302A改进的半连续活性污泥试验(SCAS)、302B赞恩-惠伦斯/EMPA试验和302C改进的MITI试验(Ⅱ)，这3个测试方法在最大限度的评价化学品的降解潜能方面存在一定不足。

3个化学品固有生物降解性测试方法中，只有302A试验在试验过程中要求不断加入生活污水，302B和302C试验都在不含其他碳源的无机培养基中进行，因此，302B和302C试验在某种程度上无法评估化学品的共代谢降解潜能。302A试验过程中虽然要求加入生活污水，但是没有明确规定生活污水的组成，由于不同地区、不同时间STP中生活污水差异较大，因此302A试验结果预期差异较大。此外，现有的固有生物降解性测试方法中，也没有对自养和异养微生物组成和比例进行明确规定。

为了评价化学品的最大生物降解能力，应该在OECD 302A、302B和302C试验的基础上，以化学品的生物降解机理为指导原则，充分考虑加入生长基质对化学品的共代谢促进作用。研究并规范生长基质(生活污水)的组成和含量，通过改变SRT、HRT以及添加生长基质等方式实现对微生物群落结构的控制。同时研究真菌漆酶和细菌等混合培养方法，合理设计试验接种物中真菌和细菌的比例，实现化学品的增强生物降解性测试方法，更好地评估化学品的最大生物降解能力。

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