RP-HPLC法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质

赵亮 徐炳欣 石晓晓 兰丙欣

RP-HPLC法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质

赵亮 徐炳欣 石晓晓 兰丙欣

目的 建立高效液相色谱法测定紫杉醇注射液的含量及有关物质的方法。方法 应用HPLC法, 色谱柱为Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 检测波长为227 nm, 柱温35℃, 流速为1.0 ml/min, 进样量为20 μl, 流动相为甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)。结果 紫杉醇浓度在10~125 mg·L-1的范围内, 溶液的浓度与色谱峰面积线性关系良好(R2=0.9998, n=6)。精密度试验RSD为0.17%(n=5), 平均加样回收率为99.33%, RSD=0.38%。结论 本方法简便、准确、快速、重复性好, 可用于紫杉醇注射液的含量测定和有关物质检查。

紫杉醇注射液；高效液相色谱法；含量测定；有关物质

紫杉醇(paclitaxel)是从短叶紫杉树皮中提取的具有抗癌活性物质, 为一种新型的抗微管药物［1］。紫杉醇的作用机制为：促进微管双聚体装配成微管, 并通过干扰去多聚化过程而使微管的稳定, 从而抑制微管网正常动力学重组, 导致细胞分裂受阻。此外, 本药还具有放射增敏效应, 可促进离子照射所致细胞损害［2,3］。临床上紫杉醇注射液主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等癌症的治疗［4,5］。药物含量是评价药品质量的重要指标之一, 为保证紫杉醇注射液的质量, 实现临床用药安全可靠, 作者尝试建立高效液相色谱法(HPLC)测定其含量。该方法准确, 重复性好, 专属性强, 与中国药典2010年版收录的紫杉醇含量测定方法相比较, 具有简便、快速的优点。

1 仪器与试药

岛津LC-15C高效液相色谱仪；岛津SPD-15C Essentia uv/vis检测器；岛津工作站LC-solution；AR 1140 型电子天平(梅特勒·托利多仪器有限公司)；KQ3200E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AUW 120D 型电子天平(日本岛津公司)。

紫杉醇对照品(许昌恒生药业有限公司提供, 纯度>99.9%, 批号为A0177)；紫杉醇注射液(购于江苏红豆衫药业有限公司, 规格5 ml/30 mg, 批号分别为20130801, 20130805, 20130809)；甲醇(色谱纯)(天津市四友精细化学品有限公司)；乙腈(色谱纯)(天津市四友精细化学品有限公司)；其它试剂均为分析纯, 水为超纯水。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 检测波长227 nm, 柱温35℃, 流速为1.0 ml/min, 进样量为20 μl, 流动相为甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)。

2. 2 对照品溶液的配制 精密称取紫杉醇对照品适量, 置于10 ml容量瓶中, 加乙醇稀释并定容至刻度, 摇匀, 得浓度为500 mg·L-1对照品贮备液。

2. 3 样品溶液的制备 分别取批号为20130801, 20130805, 20130809的3批紫杉醇注射液适量, (相当于紫杉醇6 mg)置于100 ml容量瓶中, 加乙醇稀释并定容至刻度, 摇匀即得。

2. 4 专属性试验 紫杉醇对照品(A)和样品中紫杉醇的HPLC图(B), 见图1。

图1 对照品(A)及样品(B)

2. 5 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、2.5 ml, 分别置于10 ml容量瓶中, 用乙醇稀释并定容至刻度, 摇匀, 得到对照品浓度分别为10、20、50、100、125 mg·L-1的溶液；进样, 记录峰面积值。以对照品浓度(X)为横坐标, 对照品峰面积(Y)为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程：Y=40555X-34526, R2=0.9999。由此可知紫杉醇含量在10~125 mg·L-1时线性关系良好。

2. 6 精密度试验 取“2.2”项下对照品溶液, 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次, 其峰面积的RSD为0.17%(n=5)。2. 7 稳定性试验 取“2.3”项下样品溶液(批号：20130805)在室温避光下放置, 分别于0、2、4、6、8、12 h时, 在仪器不关闭状态下测定不同时间内的含量。结果, 样品含量的RSD为0.26%(n=6), 表明样品溶液在12 h内稳定性好。

2. 8 加样回收率试验 精密量取已知含量批号为20130805的紫杉醇注射液适量(相当于紫杉醇3 mg), 分别精密加入紫杉醇对照品适量, 置于100 ml容量瓶中, 用乙醇稀释并定容至刻度, 摇匀, 按“2.1”项下实验条件进样, 结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2. 9 样品含量测定 将3批样品溶液分别按“2.1”项下实验条件进样, 结果见表2。

2. 10 有关物质检查 采用不加校正因子的主成分自身对照法。精密称取紫杉醇适量, 置10 ml 容量瓶中, 加乙醇稀释并定容至刻度, 摇匀, 制成200 mg·L-1的溶液作为供试品溶液；取供试品溶液1 ml置10 ml 容量瓶中, 加流动相稀释至刻度, 作为对照溶液。取对照溶液20 μl进样, 调节检测灵敏度, 使主峰高达到记录仪满量程的10%左右, 再取供试品溶液进样20 μl, 记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。扣除溶剂峰和辅料峰, 量取色谱图上紫杉醇色谱峰外各杂质的峰面积总和, 并与对照溶液主成分的峰面积比较, 计算杂质含量。结果见表2, 3批样品中有关物质均<1.2%。

表2 含量及有关物质测定结果

3 讨论

应用紫外分光光度计对紫杉醇在190~400 nm范围内扫描, 结果显示紫杉醇在227 nm处有较强吸收。作者采用227 nm作为该分析方法的检测波长, 可获得较高灵敏度, 基线平稳, 良好的峰形。

为了得到一个良好的分析效果, 作者在试验中对流动相进行了优化。试验分别考察了甲醇-水系统、乙腈-水系统、甲醇-乙腈-水系统, 结果发现以甲醇-乙腈-水系统为流动相, 在选定的检测波长条件下, 基线稳定, 能够得到良好的峰形, 最终确定流动相为甲醇-乙腈-水(45:30:25, v/v)为该分析方法的流动相。总之, 本方法操作简便、准确度高、重现性好, 可用于紫杉醇含量的测定与质量控制。

［1］ Jared Bushman, Asa Vaughan, Larisa Sheihet, et al. Functionalized nanospheres for targeted delivery of paclitaxel. Journal of Controlled Release, 2013,171(3):315-321.

［2］ 赵惠.紫杉醇周围神经毒性临床观察.中国实用医药, 2008, 3(13):136-137.

［3］ 龚奎玉,王志东,李建璜.中国实用医药, 2008,3(21):73-75.

［4］ Michela Di Michelea, Simone Marconea, Lucia Cicchillitti, et al. Glycoproteomics of paclitaxel resistance in human epithelial ovarian cancer cell lines: Towards the identification of putative biomarkers. Journal of Proteomics, 2010,73(5):879-898.

［5］ Rong Liua, Denis M. Gilmorea, Kimberly Ann V. Zubris, et al. Prevention of nodal metastases in breast cancer following the lymphatic migration of paclitaxel-loaded expansile nanopartic. Biomaterials, 2013,34(7):1810-1819.

Determination of paclitaxel injection and its related substances by HPLC

ZHAO Liang, XU Bing-xin, SHI Xiao-xiao,
et al. Xuchang Central Hospital, Xuchang 461000, China

Objective To establish a method for the determination of paclitaxel injection and its related substances by High Performance Liquid Chromatography(HPLC). Methods The determination was performed on the following conditions: the colum was Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), the mobile phase was methanol-acetonitrile-water (45:30:25, v/v), the detected wavelength was 227 nm, the colum temperature was 35℃, the flow rate was 1.0 ml/min, the injection volume was 20 μl. Results The linear concentration range was from 10 to 125 mg·L-1of paclitaxel(R2=0.9998, n=6). The RSD of precision test was 0.17%. The average recovery was99.33 %, RSD=0.38%. Conclusion The method is simple, accurate, rapid and reproducible. It can be used to detect the content of paclitaxel injection and its related substances.

Paclitaxel injection; HPLC; Determination; Related substances

461000 许昌市中心医院(赵亮 徐炳欣 兰丙欣)；许昌市建安医院(石晓晓)

徐炳欣 E-mail：xin4891@126.com