USP22在结直肠癌中的活化状态研究

姜争 刘彦龙 王锡山

USP家族，即泛素化特异性蛋白酶家族，通过去除共轭复合物中的泛素，进而调节一系列的细胞机制，包括前植入、生长和分化、细胞周期进展、肿瘤形成、转录活性和信号转导等[1-2]。该家族是目前已知的去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类。这些酶分子都含有两个短而保守的片段即赖氨酸盒和组氨酸盒，序列中具有起催化作用的三联残基，即半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺，能将泛素分子从大的蛋白上移除[3]。这些USP基因或为肿瘤抑制基因或为致癌基因来行使截然不同的生长调节功能。

USP22作为一种新型的去泛素化水解酶广泛表达于各种成年组织中，中等表达于心脏和骨骼肌，弱表达于肺脏、肝脏和胚胎的早期[4]。通过联合检测USP22及11-Polycomb癌症干细胞信号中的其它基因，可以预测肿瘤是否具有侵略性和耐药性等特点，使癌症患者的诊断和病情级别的划分成为可能，并且发现癌细胞如表达这种信号则会获得转移促使-失巢凋亡抑制-非整倍体-异常细胞周期控制的干细胞样表型。为了验证这种观点，我们在本文中详细探讨USP22在结直肠癌发生发展过程中的作用。

资料与方法

一、一般方法

选取哈尔滨医科大学附属二院2001至2003年手术切除的192例结直肠癌患者的存档蜡块作为实验对象，包括正常粘膜27例、腺瘤27例、腺癌192例、肝转移灶15例、淋巴结转移灶22例。其中正常粘膜、腺瘤、腺癌均取自同一患者，转移灶与原发灶相配对。对全部蜡块重新切片，行HE染色，由两位高年资病理医师进行复查。同时收集研究病例的临床病理资料。

二、实验方法

抗USP22抗体(Ⅰ抗)购自Abcam公司，为浓缩型兔抗人单克隆抗体；抗Ki-67抗体(I抗)购自Santa Cruz公司，为浓缩型鼠抗人单克隆抗体；PV免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

(一)免疫组化方法

载玻片经1 ∶10稀释的多聚赖氨酸涂片处理，4 μm石蜡连续切片。将石蜡组织切片以60℃烤60 min，常规脱蜡、水化。用新鲜配制的3% H2O2清除内源性过氧化氢酶。抗原修复，滴加4%BSA封闭非特异性抗原；将多余液体甩净后滴加1:200稀释的I抗，30℃温箱中孵育2小时后置于4℃冰箱内过夜；30℃温箱中复温2 h。PBS冲洗后加羊抗兔、抗鼠二抗工作液，30℃温箱孵育60 min；PBS洗后加三抗工作液，30℃温箱中孵育60 min；DAB显色，苏木素复染，梯度酒精上行脱水、二甲苯透明。中性树胶封片后镜检。本实验采用PBS代替一抗做为抗体对照。

(二)免疫组化评定方法

USP22蛋白阳性产物主要定位于细胞核，表现为细胞核内有棕黄色或棕褐色颗粒。阴性对照为同一批次样品，不加一抗。免疫组织化学染色结果判断标准参照[5]如下的评分方法：光学显微镜下观察组织标本的着色程度，高倍镜下(10×40)随机取4个不同视野，计数细胞总数及核阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分：0为阴性表达；1+为弱阳性，阳性细胞数为1～10%；2+为阳性细胞11～50%；3+为阳性细胞≥50%。以阳性细胞数≥10%定为USP22阳性表达。以上结果至少由2位病理科医生在双盲情况下观察确定。

(三)统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件处理数据。USP22的表达量与结直肠癌临床病理因素的关系，正常粘膜、腺瘤、腺癌及转移灶中表达的比较分别应用卡方检验和t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、在结直肠癌发生过程中USP22的表达量逐步上调

USP22除表达于少量的炎性淋巴细胞外，主要表达于结直肠上皮细胞的细胞核中(图1)。通过统计分析，USP22的表达量逐步升高，其中USP22在腺癌中的表达均明显高于正常粘膜(P<0.0001)和腺瘤(P=0.006)，但USP22在正常粘膜与腺瘤的表达差异无统计学意义(P=0.192)

二、在结直肠癌转移过程中USP22的表达量逐步上调

与原发灶比较，USP22在淋巴结转移灶中的表达升高无差异(P=0.052)，在肝转移灶中的表达则显著升高(P=0.021，图2)。

三、USP22的表达与临床病理资料相关性分析结果

在192例原发灶中，104例(54.16%)呈阳性表达。USP22 的表达与患者的性别(χ2=4.642，P=0.031)、肿瘤大小(χ2=9.067，P=0.003)、浸润深度(χ2=22.543，P<0.0001)、淋巴结状态(χ2=8.066，P=0.005)及 Ki-67 的表达(χ2=37.829，P<0.0001)高度相关，而与患者的年龄、肿瘤部位无相关性(表1)。

注：a图为USP22在细胞核中组织免疫化学染色图像；b图为USP22在淋巴细胞中组织免疫化学染色图像

注：a图为在结直肠癌转移过程中USP22在原发灶中免疫组织化学染色图像；b图为在结直肠癌转移过程中USP22在转移灶中免疫组织化学染色图像

表1 USP22表达与临床病理因素相关性分析情况表

变量数量USP22阴性USP22阳性P值年龄(岁) <6010347560.952 ≥60894148性别 男11244680.031 女804436肿瘤部位 结肠7631450.301 直肠1165759肿瘤大小(cm) <57645310.003 ≥51164373浸润深度 T1-31046440<0.0001 T4882464淋巴结受累程度 N011261510.005 N1-2802753Ki-67表达 阴性695217<0.0001 阳性1233687

讨 论

USP22作为一种新型的去泛素化水解酶广泛表达于各种成年组织，如中等表达于心脏、骨骼肌，弱表达于肺脏、肝脏和胚胎的早期[4]。通过联合检测USP22及11-Polycomb/癌症干细胞信号中的其它基因，可以预测肿瘤是否具有侵略性和耐药性等特点，使癌症患者的诊断和病情级别的划分成为可能，并且发现癌细胞如表达这种信号则会获得转移促使-失巢调亡抑制-非整倍体-异常细胞周期控制的干细胞样表型。为了验证这种观点，我们重点论述了USP22在结直肠癌发生发展过程中及其在指导预后方面的作用。

我们通过免疫组化检测USP22在粘膜、腺瘤、腺癌及其转移灶中的表达情况，发现随着结直肠癌的发生发展，USP22的表达量逐步升高。与粘膜和腺瘤相比，USP22在癌灶中的表达量最高，这说明致癌基因USP22的活化状态会促进结直肠癌的发生发展。而且，与原发灶相比较，USP22在肝转移灶中的表达显著增高。这说明USP22的表达升高会促进结直肠癌的转移，尤其是肝转移，这也支持PcG通路的活化可能介导实体瘤转移这一假设[6]。

通过本研究发现USP22与Ki-67的表达高度相关，这说明高表达USP22的肿瘤细胞其增殖能力强，这也同样符合Polycomb/癌症干细胞信号可以准确预测恶性肿瘤细胞的生长状态的假设[7]，USP22编码的蛋白是一种酶，容易受到药物的影响，可能会成为抗肿瘤药物的理想靶点。

[1] Baek KH.Conjugation and deconjugation of ubiquitin regulating the destiny of proteins.Exp Mol Med，2003，35(1):1-7.

[2] Kim JH,Park KC,Chung SS,et al.Deubiquitinating enzymes as cellular 135 regulators.J Biochem，2003，134(1):9-18.

[3] Pajor AM,Kahn ES,Gangula R.Role of cationic amino acids in the Na+/dicarboxylate co-transporter NaDC-1.Biochem J，2000，350(3):677-683.

[4] Lee HJ,Kim MS,Shin JM,et al.The expression patterns of deubiquitinating enzymes,USP22 and Usp22.Gene Expr Patterns，2006，6(3):277-284.

[5] Silva J,García JM,PeC,et al.Implication of olycomb members Bmi-1,Mel-18,and Hpc-2 in the regulation of 16INK4a,p14ARF,h-TERT,and c-Myc expression in primary breast arcinomas.Clin Cancer Res，2006，12(23):6929-6936.

[6] Berezovska OP.Essential role for activation of the Polycomb group PcG protein chromatin 145 silencing pathway in metastatic prostate cancer.Cell Cycle，2006，5(16):1886-1901.

[7] 黄甜,聂绍发,柳巍,等.大肠癌患者生存时间影响因素分析.中国公共卫生，2008，24(1):73-74.