HPLC法同时测定银黄颗粒中三种黄酮类成分的含量

于百富+++++陈辉

[摘要] 目的 建立同时测定银黄颗粒中三种黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素）的含量的高效液相色谱方法。 方法 采用Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇-0.2%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长为275 nm，柱温30℃，进样量20 μl。 结果 三种成分在建立的方法下分离良好，在考察的浓度范围内，浓度与峰面积之间呈良好的线性关系（r>0.9997）；回收率（n=9）均在94.4%～1a04.7%范围，RSD均<2.1%。 结论 本方法简便、准确，精密度高，重复性好，可以用于银黄颗粒的质量控制。

[关键词] 高效液相色谱法；银黄颗粒；黄酮类成分；含量测定

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）07（a）-0053-03

银黄颗粒是由金银花和黄芩两味中草药提取物组成的复方制剂，具有清热、利咽、解毒作用。临床上主要用于治疗外感风热引起的咽干、咽痛、发热以及扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等多种疾病。黄芩富含多种物质，其中含量较高并且具有显著药理活性的化合物是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷等黄酮类化合物[1-7]。银黄颗粒大多以黄芩苷和绿原酸作为质量控制指标[8-11]，监测其内在质量，因这种简便单一的质量控制模式存在一定缺陷，为非法添加埋下了隐患。

中国药典（2010版）[12]对银黄颗粒的质控是通过测定绿原酸和黄芩苷两种成分，对这两种测定成分采用不同的样品处理方法及色谱条件，步骤繁琐，且对具有活性成分的黄芩素、汉黄芩苷未进行有效质控。

选择黄芩苷等三种成分作为质量控制的指标，可有效地反映银黄颗粒真正的内在质量，并为全面评价其质量控制提供有效依据。本试验以金银花和黄芩两种中药材的已知有效成分为基础，应用梯度洗脱法构建能同时测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化学成分的高效液相色谱法，旨在为银黄颗粒的内在质量控制提供更好的依据。

1 仪器与试剂

美国Agilent 1260高效液相色谱仪系统，AE240电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多）。对照品购于中国药品生物制品检定所；银黄颗粒来自本院和药店，生产厂家及药品批次分别为：①云南永安制药有限责任公司（批号1100303）、②西安交大药业（集团）有限责任公司（批号110624）、③河南宛西制药股份有限责任公司（批号110701）。应用的试剂中，乙腈、甲酸、乙酸、甲醇为色谱纯，实验用水为纯化水，其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：（A：0～15 min，20%；15～40 min，20%～40%；40～80 min，40%～45%；80～90 min，45%～50%；90～120 min，50%～55%；120～135 min，55%）；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；柱温：30℃；进样量：20 μl。

2.2 供试品溶液的制备

将银黄颗粒去外包装，用适当方法研细，精密称取细粉1.0 g，置于50 ml量瓶中，加入甲醇40 ml，超声提取20 min（功率350 W，频率45 KHz），放至室温，用甲醇稀释至刻度。混合均匀，取上清液过滤，即得。

2.3 对照品储备液的制备

精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的对照品适量，分别用甲醇溶解稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/ml的对照品储备溶液，备用。

2.4 系统适用性试验

分别准确量取适量的各对照品储备液，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素浓度分别为400.00、100.00、80.00 μg/ml的混合溶液作为对照品。取对照品溶液、供试品溶液，分别测得三种黄酮类成分的混合对照品、样品溶液的色谱图（图1）。通过计算分离度>1.5，理论板数均>3000。

图1 275 nm下的HPLC-DAD色谱图

A.混合对照品，B.银黄颗粒样品；1.黄芩苷，2.汉黄芩苷，3.黄芩素

2.5 线性关系的考察、检出限和定量限

精密吸取混合对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，逐步稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，进行测定。以信噪比10∶1求得定量限（LOQ），以信噪比3∶1求得检出限对照品（LOD）。按规定色谱条件测定。结果表明三种化合物均有良好的线性关系，定量检出限（S/N=10）在1.08～1.55 μg/ml（表1）。

表1 三种化合物的回归方程、相关系数、线性范围和检出限（n=3）

2.6 精密度试验

称取上述实验已研细的银黄颗粒细粉1.0 g，精密称定，按规定方法制备供试品溶液，连续进样6次，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的峰面积，结果上述3种黄芩黄酮类成分峰面积的RSD分别为0.68%、0.19%、0.85%，表明该测定方法批内精密度良好。取上述实验已研细的银黄颗粒细粉1.0 g，精密称定，按规定的方法制备供试品溶液，连续进样6次样品3批，计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积的RSD分别为1.35%、0.96%、1.59%，表明仪器的批间精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密称取银黄颗粒细粉1.0 g，制备成供试品溶液，按2.1同样色谱条件，分别于0、4、8、12、24 h进样20 μl测定。通过计算黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素峰面积的RSD分别为1.77%、1.56%、1.81%。表明供试品溶液在室温下放置24 h银黄颗粒中的三种被测成分均较稳定。

2.8 重复性试验

精密称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素平均含量分别为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分别为0.71%、1.44%、1.48%。表明该方法具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验

取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g共计9份，分别按样品含量：对照品加入量为（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的对照品溶液，按规定方法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。结果上述三种黄芩黄酮类成分，加样平均回收率分别为106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明该方法的准确度良好。

表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率试验结果

2.10 样品含量的测定

分别测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，可以看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因此建议生产厂家要对批间生产过程进行有效控制，保证其有效成分的含量基本稳定。

表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定结果（mg/g，n=3，x±s）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

本研究在190～400 nm波长范围内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其分别在277、273、275 nm波长处有最大吸收峰，故选择275 nm作为测定波长。

3.2 色谱条件的选择

乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，通过比较，两者都可以产生较好的分离效果，但甲醇成本和毒性更低，故选择甲醇作为洗脱剂。由于黄酮类成分在酸性环境下能达到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通过优化梯度洗脱，最终达到较好的峰形和分离度。

本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定方法，该方法简便、准确，精密度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量控制提供依据。

[参考文献]

[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究[J].中国药房，2008，19（9）：644-649.

[2] 吴莹，金叶智，吴珺，等.黄芩主要成分体外抗甲型流感病毒作用的研究[J].北京中医药大学学报，2010，33（8）：541-545.

[3] 周锡钦，张庆英，梁鸿，等.黄芩中主要黄酮类成分的含量分析[J].中国中药杂志，2009，34（22）：2910-2915.

[4] 李小芩，孙晓红，蔡爽，等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚类分析研究不同品种金银花的化学成分及其差异[J].药学学报，2009，44（8）：895-904.

[5] Han J，Ye M，Xu M，et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，848（2）：355-362.

[6] 马双成，刘燕，毕培曦，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的黄酮类成分的定量研究[J].药物分析杂志，2006， 26（4）：426-430.

[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法同时测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].中国药房，2010，21（11）：1016-1018.

[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC同时测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国现代应用药学，2009，26（5）：417-419.

[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].中国中药杂志，2010，35（2）：166-168.

[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国试验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文编辑：李亚聪）

2.8 重复性试验

精密称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素平均含量分别为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分别为0.71%、1.44%、1.48%。表明该方法具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验

取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g共计9份，分别按样品含量：对照品加入量为（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的对照品溶液，按规定方法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。结果上述三种黄芩黄酮类成分，加样平均回收率分别为106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明该方法的准确度良好。

表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率试验结果

2.10 样品含量的测定

分别测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，可以看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因此建议生产厂家要对批间生产过程进行有效控制，保证其有效成分的含量基本稳定。

表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定结果（mg/g，n=3，x±s）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

本研究在190～400 nm波长范围内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其分别在277、273、275 nm波长处有最大吸收峰，故选择275 nm作为测定波长。

3.2 色谱条件的选择

乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，通过比较，两者都可以产生较好的分离效果，但甲醇成本和毒性更低，故选择甲醇作为洗脱剂。由于黄酮类成分在酸性环境下能达到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通过优化梯度洗脱，最终达到较好的峰形和分离度。

本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定方法，该方法简便、准确，精密度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量控制提供依据。

[参考文献]

[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究[J].中国药房，2008，19（9）：644-649.

[2] 吴莹，金叶智，吴珺，等.黄芩主要成分体外抗甲型流感病毒作用的研究[J].北京中医药大学学报，2010，33（8）：541-545.

[3] 周锡钦，张庆英，梁鸿，等.黄芩中主要黄酮类成分的含量分析[J].中国中药杂志，2009，34（22）：2910-2915.

[4] 李小芩，孙晓红，蔡爽，等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚类分析研究不同品种金银花的化学成分及其差异[J].药学学报，2009，44（8）：895-904.

[5] Han J，Ye M，Xu M，et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，848（2）：355-362.

[6] 马双成，刘燕，毕培曦，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的黄酮类成分的定量研究[J].药物分析杂志，2006， 26（4）：426-430.

[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法同时测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].中国药房，2010，21（11）：1016-1018.

[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC同时测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国现代应用药学，2009，26（5）：417-419.

[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].中国中药杂志，2010，35（2）：166-168.

[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国试验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文编辑：李亚聪）

2.8 重复性试验

精密称取银黄颗粒细粉1.0 g，平行制备6份供试品溶液，测定峰面积并计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素平均含量分别为50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分别为0.71%、1.44%、1.48%。表明该方法具有良好的重复性。

2.9 加样回收率试验

取已测定含量的银黄颗粒细粉0.5 g共计9份，分别按样品含量：对照品加入量为（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的对照品溶液，按规定方法制备实验用供试品溶液，测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素的加样回收率及RSD。结果上述三种黄芩黄酮类成分，加样平均回收率分别为106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明该方法的准确度良好。

表2 银黄颗粒中三种黄酮类成分的回收率试验结果

2.10 样品含量的测定

分别测定3个不同厂家批号的银黄颗粒中三种黄酮类化合物的含量，可以看出，生产厂家不同银黄颗粒中三种被测成分的含量有较大差异（表3），因此建议生产厂家要对批间生产过程进行有效控制，保证其有效成分的含量基本稳定。

表3 三批银黄颗粒中三种化合物的含量测定结果（mg/g，n=3，x±s）

3 讨论

3.1 测定波长的选择

本研究在190～400 nm波长范围内对黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素三种化合物进行了紫外全波长扫描，其分别在277、273、275 nm波长处有最大吸收峰，故选择275 nm作为测定波长。

3.2 色谱条件的选择

乙腈和甲醇是常用的液相色谱洗脱剂，通过比较，两者都可以产生较好的分离效果，但甲醇成本和毒性更低，故选择甲醇作为洗脱剂。由于黄酮类成分在酸性环境下能达到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通过优化梯度洗脱，最终达到较好的峰形和分离度。

本文构建了银黄颗粒中三种黄酮类成分含量的测定方法，该方法简便、准确，精密度高，重复性好，能为银黄颗粒的全面质量控制提供依据。

[参考文献]

[1] 陈勇川，谢林利，熊丽蓉，等.黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性的逆转作用研究[J].中国药房，2008，19（9）：644-649.

[2] 吴莹，金叶智，吴珺，等.黄芩主要成分体外抗甲型流感病毒作用的研究[J].北京中医药大学学报，2010，33（8）：541-545.

[3] 周锡钦，张庆英，梁鸿，等.黄芩中主要黄酮类成分的含量分析[J].中国中药杂志，2009，34（22）：2910-2915.

[4] 李小芩，孙晓红，蔡爽，等.采用UPLC-ESI-MS/MS以及主成分聚类分析研究不同品种金银花的化学成分及其差异[J].药学学报，2009，44（8）：895-904.

[5] Han J，Ye M，Xu M，et al.Characterization of flavonoids in the traditional Chinese herbal medicine-Huangqin by liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，848（2）：355-362.

[6] 马双成，刘燕，毕培曦，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的黄酮类成分的定量研究[J].药物分析杂志，2006， 26（4）：426-430.

[7] 阚红玉，宋殿荣，王跃飞，等.HPLC法同时测定黄芩中5种黄酮类成分的含量[J].中国药房，2010，21（11）：1016-1018.

[8] 黄雄，黄嬛，黄佳，等.HPLC同时测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国现代应用药学，2009，26（5）：417-419.

[9] 白雁，张威，王星，等.近红外光谱法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷含量[J].中国中药杂志，2010，35（2）：166-168.

[10] 张婷，美尔哈巴·热西提，林潇，等.HPLC-MS/MS法测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷[J].中草药，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，杨菲，等.RP-HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国试验方剂学杂志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文编辑：李亚聪）