ASIP蛋白与AgRP相关蛋白生物信息比较分析

马建青，李祥龙,2*，周荣艳，李兰会，杨清芳

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；2.河北科技师范学院 动物科技学院，河北 昌黎 066600；3.河北省邢台市农业局动物疫病预防控制中心，河北 邢台 054001)

科学研究

ASIP蛋白与AgRP相关蛋白生物信息比较分析

马建青1，李祥龙1,2*，周荣艳1，李兰会1，杨清芳3

(1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；2.河北科技师范学院 动物科技学院，河北 昌黎 066600；3.河北省邢台市农业局动物疫病预防控制中心，河北 邢台 054001)

利用生物信息学的方法研究人、绵羊和牛等18个物种Agouti 信号蛋白(ASIP)和Agouti 相关蛋白(AgRP)的编码区及其对应氨基酸序列的相关特征，以期探明两种蛋白的遗传分化特点。结果表明，在ASIP与AgRP均为399bp的CDS序列中，其核苷酸保守区域的位置分别在262～399 bp和230～399 bp处；ASIP和AgRP在各自CDS序列多态位点变异的各项指标数值及其百分率大小上均极为接近；在46条ASIP的CDS序列及32条AgRP的CDS序列中，二者的单倍型数分别为22种和23种，ASIP和AgRP在基因的进化以及不同物种的遗传分化上具有相似性；两者的氨基酸序列在98～140 aa片段处保守性较高，该区域同时富含半胱氨酸(Cys)；ASIP和AgRP一级结构的理化性质表现为共性与差异并存；二者的肽链C端具有相似的三维结构，但各自也具有其结构特异性。

Agouti；ASIP；AgRP；生物信息学

Agouti基因，通常翻译成“南美豚鼠外表颜色基因”[1]或者“刺豚鼠毛色基因”、“鼠灰色基因”[2]。Agouti信号蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)是Agouti基因编码的产物。继ASIP发现之后，研究人员在寻找Agouti同源基因时又发现了此同源基因编码的一种与蛋白ASIP的大小与结构相似的同源蛋白，即Agouti相关蛋白(Agouti-related protein,AgRP)[3-4]。

已有研究表明，ASIP发挥生物学功能是通过与黑素皮质素受体信号转导途径中的受体(melanocortin receptors,MC-R,如MC1-R、MC3-R及MC4-R) 相互作用，从而影响动物皮毛颜色的形成、能量代谢、肥胖、糖尿病以及肿瘤的发生和性功能等[5-6]。而AgRP的生物学功能是作为一种摄食神经肽，通过拮抗α-黑素细胞刺激素与之竞争结合MC3-R及 MC4-R受体，促使机体摄取更多的食物，增加能量，引起多食和肥胖症的发生[3]。由此可见，二者均对生物体能量代谢调控具有重要作用，且均可导致机体肥胖。

为探究两种蛋白在核苷酸序列和氨基酸序列水平上的相似性和差异性及其二者的联系，本文利用生物信息学的方法研究了人(Homosapiens)、绵羊(Ovisaries)和牛(Bostaurus)等18个物种ASIP和AgRP的完全编码区及对应氨基酸序列的相关特征，旨在探明两种蛋白的遗传分化特点，为生物体的能量代谢调控、肥胖症和糖尿病等疾病的发生和动物遗传育种研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 序列来源

ASIP和AgRP的完全编码区(CDS)序列和氨基酸序列从NCBI网站的GenBank中下载，本研究分别下载了人、绵羊、牛、家猫、野猪、褐家鼠、黑猩猩、大猩猩、东非狒狒、猕猴、北美鼠兔、小家鼠、虎鲸、欧洲兔、家马、小耳大婴猴、大熊猫和非洲象共计18个不同物种的46条ASIP的CDS序列和18条氨基酸序列及32条AgRP的CDS序列和18条氨基酸序列(表1)。

表1 ASIP和AgRP CDS区序列和氨基酸序列来源Table 1 The CDS sequence and amino acid sequences of ASIP and AgRP

注：第2、3、4列中加粗字体代表AgRP的序列信息，不加粗字体代表ASIP的序列信息。

Note:In the 2nd,3rd and 4th column,the bold fonts denote the sequences information of AgRP,while the normal fonts denote the sequence information of ASIP.

1.2 分析方法

首先对表1中46条ASIP的CDS序列及32条AgRP的CDS序列以及两种蛋白的各18条氨基酸序列用生物学软件BioEdit分别进行比对分析，然后编辑共有的编码区和氨基酸序列进行比较，分析比对后的序列特征。二者遗传多态性的各项指标及单倍型的生成利用DnaSP5.10软件进行分析。 在线软件工具ProtParam用来分析ASIP和AgRP氨基酸序列的理化性质。蛋白质同源建模SWISS-MODEL软件用来预测ASIP和AgRP蛋白的三级结构。

2 结果与分析

2.1 ASIP及AgRP的CDS序列特征

2.1.1 保守区域分析 在所分析的均为399个位点的ASIP和AgRP的CDS序列中，二者核苷酸保守区域的位置分别在262～399 bp和230～399 bp处，各自的序列保守度值(Sequence conservation)很相近(0.491和0.476)，保守区域的保守阈值(Conservation threshold)分别为59和57。

2.1.2 多态位点变异 在所研究的不同物种46条ASIP的CDS序列及32条AgRP的CDS序列中，共计发现有多态位点数分别为203和207个，其百分率分别约为50.9%和51.9%，其中包含的单一多态位点数各为63个和64个，其百分率各约为15.8%和16.8%；二者所拥有的简约多态位点分别为140个和143个，其百分率分别约为35.1%和35.8%；突变总数各为258个和288个(表2)。分析显示,ASIP和AgRP二者在各自CDS序列多态位点变异的各项指标对应的数值大小及其百分率上均极为接近。就二者各自的突变总数来看，ASIP的CDS区中包含258个，AgRP的CDS区中包含288个，相差数目比其他指标变化较大。

表2 ASIP及AgRP的CDS序列多态信息Table 2 The polymorphic information of CDS sequences of ASIP and AgRP

注:括号中数字为百分率。

Note: The values in the brackets are percentages.

2.1.3 单倍型及其多样性 根据序列比对分析，发现二者的单倍型数分别为22种和23种。二者各自单倍型所包括序列信息见表3和表4。由表中的信息可以看出在两种蛋白各自的完全编码区中，人、小家鼠和野猪三个物种均分化出不同种类的单倍型。此外，ASIP的CDS序列中，大猩猩和绵羊以及AgRP的CDS序列中的牛分别分化出了不同种类的单倍型。同时由软件计算出的二者单倍型(基因)多样性值较为接近(分别为0.964和0.939)，而二者的核苷酸多样性值分别为0.146和0.113，核苷酸差异平均数分别为57.522和45.160。

2.2 ASIP及AgRP的氨基酸序列特征

2.2.1 蛋白一级结构比对分析 AgRP与ASIP在氨基酸序列上具有25%相似性,且C端含有特征性的半胱氨酸(Cys)结构域[3]。利用BioEdit软件对比对后的两种蛋白的氨基酸序列进行分析，发现两者在氨基酸序列98～140 aa约40个氨基酸片段处保守性较高，该区域同时富含Cys，见图1。

2.2.2 氨基酸序列理化性质分析 利用在线软件ProtParam分析ASIP以及AgRP的氨基酸序列理化性质见表5。将表2中两种蛋白所对应物种的氨基酸序列经软件分析后，求取各项指标的算术平均值。分析及计算结果的表明，ASIP及AgRP的平均分子量基本相同，ASIP的疏水性均值和脂溶指数均值都要小于AgRP对应的值，而ASIP的理论等电点均值和不稳定系数均值均大于AgRP相对应的值。

2.2.3 ASIP和AgRP蛋白三级结构预测 由上述可知，ASIP和AgRP在富含Cys的C端氨基酸序列较为保守且同源性较高，而且也已有研究表明，ASIP和AgRP在其C末端具有相似的三维空间结构，但是二者在发挥生物学功能的时候是通过结合不同的黑素皮质素受体实现的[3]。为了探究这一问题的原因，本研究中利用蛋白质同源建模SWISS-MODEL软件预测构建了ASIP及AgRP蛋白C末端的三维空间结构见图2。从预测的结果分析，ASIP与AgRP多肽链在C端具有相似的三维结构，虽然二者为同源蛋白，但是在结构上仍存在明显差异。AgRP肽链C端的二级结构中包含一个β-折叠片段，而且在这一β-折叠的侧链中有三个重要的芳香族氨基酸残基即109位和118位的酪氨酸(Tyr)及116位的苯丙氨酸(Phe)，这一片端的稳定性对于AgRP蛋白的氧化折叠极为关键[7-8]。Joseph等[8]由AgRP蛋白C端的二级结构推测在与AgRP蛋白同源的C端区域，ASIP蛋白包含两个芳香族氨基酸残基。

表3 各单倍型在ASIP的CDS序列中的分布Table 3 The distribution of CDS sequences of ASIP for each haploid

表4 各单倍型在AgRP的CDS序列中的分布Table 4 The distribution of CDS sequences of AgRP for each haploid

图1 ASIP和AgRP蛋白质一级结构氨基酸保守度差异比较Fig.1 Conserved amino acid difference comparison for the protein primary structure of ASIP and AgRP

注： 1，19.代表物种人；2，28.猕猴；3，33.黑猩猩；4，23.野猪；5，22.小家鼠；6，25.家马；7，26.家猫；8，24.欧洲兔；9，34.东非狒狒；10，20.褐家鼠；11，27.黑猩猩；12，29.北美鼠兔；13，31.小耳大婴猴；14，30.虎鲸；15，35.大熊猫；16，21.牛；17，36.非洲象；18，32.绵羊。柱形图表示氨基酸种类保守度差异，其中氨基酸保守度半胱氨酸>苯丙氨酸和丙氨酸>精氨酸和缬氨酸。

Note:1，19.representHomosapiens；2，28.Macacamulatta；3，33.Pantroglodytes；4，23.Susscrofa；5，22.Musmusculus；6，25.Equuscaballus；7，26.Feliscatus；8，24.Oryctolaguscuniculus；9，34.Papioanubis；10，20.Rattusnorvegicus；11，27.Pantroglodytes；12，29.Ochotonaprinceps；13，31.Otolemurgarnettii；14，30.Orcinusorca；15，35.Ailuropodamelanoleuca；16，21.Bostaurus；17，36.Loxodontaafricana；18，32.Ovisaries).The histogram stands for difference of conservative degrees which is Cysteine>Phenylalanine and alanine>Arginine and valine.

表5 ASIP和AgRP氨基酸序列理化性质参数Table 5 Physicochemical property parameter of amino acid sequences for ASIP and AgRP

图2 ASIP和AgRP蛋白C端三级结构预测(左：ASIP;右：AgRP)
Fig.2 Tertiary structure prediction of C-terminal of ASIP and AgRP(left: ASIP,right: AgRP)

3 讨 论

本研究发现ASIP和AgRP两种蛋白在各自的CDS区中存在同源性较高的保守核苷酸序列，且它们的位置很相近。二者的序列保守度值和保守区域阈值也很相近，且在基因表达方面，细胞中核苷酸的排列顺序指导蛋白质的生成，由此推测二者在相似位置上核苷酸序列的同源性和保守性是使二者进化为同源蛋白的基础之一。二者CDS序列中的可变多态位点数、单一多态位点数和简约多态位点数及其各自所占的百分率数值基本一致，由此判断ASIP和AgRP在基因的进化上以及不同物种的遗传分化上具有相似性。但是同时发现二者在突变总数这一指标上差别明显。虽然在它们的CDS区中存在同源性较高的保守序列，但仍有较大的突变总数差异，这也说明了AgRP的基因多态性相比ASIP丰富一些。另外，出现这一情况的原因可能在于选取的两种蛋白的CDS序列数的差别较大，亦或是所选序列的基因本身存在突变特异性所致。由二者单倍型种类也推断出了编码ASIP和AgRP的两种基因在物种间和物种内均出现了不同程度的遗传分化，且二者在遗传分化方面具有相似性和各自的分化特点。对于本研究中Hap-7黑猩猩和大猩猩归属于同一种单倍型，这与动物分类学相符合，而本研究中却未出现此情况，出现这个问题的原因可能是因为本研究中选取的序列条数有限也可能是由于二者编码蛋白的基因本身的变异特异性造成的。

作为同源蛋白的ASIP和AgRP在氨基酸序列和蛋白结构上的相似性与差异性是国内外研究的热点。本研究通过比对ASIP和AgRP蛋白的一级结构，预测出了两蛋白氨基酸保守序列，得到的结果与前人研究结论一致[14]。富含Cys的保守区域对蛋白质高级结构的形成具有重要作用。二硫键是由处在同一肽链不同位置或不同肽链中的两半胱氨酸侧链的巯基(-SH)氧化后相连接而成，是一种比较稳定的共价键。在有二硫键存在的蛋白质中，二硫键对三级结构的稳定具有很重要的作用。Cys中含有巯基，因此推测在ASIP和AgRP两蛋白的C端富含的10个Cys会因氧化作用形成多个二硫键，这便稳定了两蛋白的高级构象。而且ASIP与AgRP蛋白之所以均会与不同类型的黑素皮质素受体结合很可能与蛋白本身二硫键维持的高级构象相关。本研究中，ASIP和AgRP的平均分子量大小基本相等，二者的多肽链均表现为亲水性。在两蛋白的理论等电点均值、不稳定系数均值和脂溶指数均值三个指标中，虽然在数值上不太一致，但二者的多肽链均表现为碱性、不稳定和具有脂溶性。值得注意的是，AgRP的理论等电点均值为7.15，接近于中性，且与ASIP的理论等电点均值在数值上差别较大，具体原因需要进一步用试验来验证。二者的多肽链同具有脂溶性，说明其在多肽链的组成上碳链较为丰富。从ASIP和AgRP蛋白三级结构预测结果发现二者在结构上具有相似的结构域，但也存在明显差异。本研究预测的ASIP及AgRP蛋白C端三级结构与Joseph 等[8]对其结构的预测存在差异，具体原因可能在于所选取的物种的氨基酸序列或者片段不同，也可能在于所应用的蛋白质结构预测软件内部参数的不同所致，具体原因有待于进一步更深入全面的研究，同时还需要结合相关的试验来验证。

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BioinformaticsComparativeAnalysisofAgoutiSignalingProteinandAgouti-RelatedProtein

MA Jian-qing1,LI Xiang-long1,2*,ZHOU Rong-yan1,LI Lan-hui1,YANG Qing-fang3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding,Hebei071001,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Changli,Hebei066600,China；3.AnimalDiseasePreventionandControlCenter,XingtaiAgricultureBureau,Xingtai,Hebei054001,China)

The characteristics of the Agouti Signaling Protein (ASIP),the complete coding region (CDS) of Agouti-Related Protein (AgRP) and the corresponding amino acid sequence of 18 species were analyzed through bioinformatic method to explore the genetic characteristics of ASIP and AgRP,and to provide basic data for the energy metabolism of the organism.The results showed that the nucleotide conservative regions of the two kinds of CDS sequence with ASIP and AgRp both being 399 sites were 262 to 399 bp and 230 to 399 bp sites; and all the values of ASIP and AgRP polymorphic sites variation indicators were compared and their percentages were rather close.The numbers of haploid were 22 and 23 for both 46 sequences of ASIP CDS and 32 sequences of AgRP CDS respectively; the evolution and genetic differentiation of ASIP and AgRP were similar.Their amino acid sequence was more conservative in 98-140 aa amino acids segment,and the region was also rich in Cys.Despite of similar three-dimensional structure in the c-terminal,structure specificity of ASIP and AgRP can be observed.

Agouti; ASIP; AgRP; bioinformatics

2013-09-08，

2013-10-14

国家自然科学基金(31172196)；河北省高等学校创新团队领军人才培育计划(LJRC004)；河北省现代农业产业技术体系蛋鸡产业创新团队资助

马建青(1988-)，女，河北邢台人，在读硕士，主要从事动物遗传学研究。E-mail：majianqing2006@126.com

*[通讯作者]李祥龙(1963-)，男，河北丰南人，博士，教授，博士生导师，主要从事动物遗传育种研究。E-mail：lixianglongcn@yahoo.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0009-06