离体猪心脏的保存及功能评价

刘 洋，李攀阳，张伟华，秦广启，陈雪梅，廖秋明，Steen Stig，乔晨晖#

1)郑州大学第一附属医院心血管外科 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 郑州 450001 3)瑞典隆德大学生命科学实验室 隆德 22594

离体猪心脏的保存及功能评价

刘 洋1)，李攀阳2)，张伟华1)，秦广启3)，陈雪梅2)，廖秋明3)，Steen Stig3)，乔晨晖1)#

1)郑州大学第一附属医院心血管外科 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院人体解剖学教研室 郑州 450001 3)瑞典隆德大学生命科学实验室 隆德 22594

#通讯作者，男，1961年9月生，博士，教授，研究方向：心脏移植，E-mail：qchenhui@hotmail.com

心脏功能；心脏保存；离体心脏；猪

目的：探索一种新型供体心脏体外保存及功能评价的方法。方法将血型一致的12头瑞典健康家猪作为实验对象，随机分为心脏供体组和血液供体组两组，每组6头。用体外循环机以不同流量(0.76、1.00、2.00、3.00、4.00 L/min)在37 ℃条件下灌注离体心脏，监测动静脉血气和离体心脏血压、心率、心肌耗氧量及氧摄取率。结果不同灌注流量下，离体心脏心肌耗氧量、心率、收缩压、平均压、左室收缩压差异均有统计学意义(F=23.500，331.010，77.701，10.101和89.301，P均<0.001)。灌注流量较高，离体心脏上述各指标也较高(F=0.460，P>0.05)。不同灌注流量组心肌氧摄取率差异无统计学意义(F=0.426，P=0.788)。结论该模型可使离体心脏心功能保持良好并得到较好的保存。

心脏移植是治疗终末期心脏病的有效手段，供体心脏的保存质量是心脏移植成功的关键[1]。目前临床上供体心脏保存以低温缺血保存为主，但是保存时间有限，难以突破4～6 h[2]。为了延长离体心脏保存时间，近年来人们探讨了多种方法，其中机械辅助心肌灌注下猪心脏跳动供心保存模型成为研究热点之一[3]。作者利用离体心脏持续灌注系统，测定了恒定温度(37 ℃)不同灌注流量条件下离体猪心脏左室收缩压、舒张压、心肌耗氧量[1]、心率等指标，评价离体心脏功能，探索新型供体心脏保存及功能评价方法。

1 材料与方法

1.1实验动物将血型一致的12头健康瑞典家猪作为实验对象，雌雄不拘，体重55～65(60±5) kg，分为2组，每组6头，一组为血液供体，另一组为心脏供体。实验动物由瑞典隆德大学生命科学实验室提供，该研究经瑞典隆德大学实验动物伦理委员会批准。

1.2主要药品及仪器①药品:盐酸氯胺等麻醉用药物、HOSPIRA’s心脏保护液、KH灌注液[4]等购自德国默克公司。②仪器：CM-4000型超声多普勒血流检测仪、Servo 300A型呼吸机(挪威)，ABL-725型血气分析仪、HP78356B型血压监测仪(丹麦),NPD28型除颤仪、T201型超声血流探头(瑞典)，CO80215型COBE体外循环机(美国)，自制血槽及心脏储存槽等。

1.3术前准备及麻醉方法动物术前12 h禁食水,肌内注射盐酸氯胺酮20 mg/kg、甲苯噻嗪1 mg/kg、阿托品0.5 mg/60 kg进行诱导麻醉，经耳缘静脉置入留置针，静脉注射硫喷妥钠注射液8.25 mg/kg。将家猪置于37 ℃恒温手术台,取平卧位。颈前正中切口，气管切开，插管(8号)，接呼吸机辅助呼吸，采用容量控制模式，调节压力，呼吸末正压达0.392 kPa,通气量为9 L/min，呼吸频率20 min-1，吸入氧浓度50%。肌内注射链霉素12 mg/kg以防感染。在右侧颈内动脉置入一个动脉插管，用于动脉血压和动脉血气测定。在颈内静脉置入两个静脉插管，一个连接微量泵，给予800 mg/h盐酸氯胺酮、80 mg/h罗库溴铵持续麻醉，另一个备用，以便快速补液及纠正酸碱平衡。麻醉前动物均进行了动静脉插管准备。

1.4离体心脏的制备和保存

1.4.1 离体心脏的制备 将供体猪正中开胸，剪开心包，游离肺动脉备用，全身肝素化，经升主动脉根部顺行灌注HOSPIRA’s心脏保护液停跳心脏，切除并取出，置于4 ℃ HOSPIRA’s心脏保护液中，开放上、下腔静脉，将一个6号手术用手套作为左房后壁与离体心脏残余左房吻合(6号手套用于容纳一定量血液，且有一定弹性)，使之成为完整心腔，扩大左房容量。将连接体外循环机的3/8软管插入中指并固定，作为左房血供通路，在心尖处置入并固定一个8号婴儿胃管，用于监测左心室血压并抽取动脉血气。在冠状窦口置入并固定一个8号婴儿胃管用于抽取静脉血气，称重后将离体心脏放入4 ℃ HOSPIRA’s心脏保护液中0.5 h。在主动脉根部置入一个8号婴儿胃管，用于监测离体心脏收缩压、平均压，并用3/8软管将主动脉与动脉血槽相连接。钝性分离冠状动脉左前降支中上1/3，用于放置血流探头。实验过程中保持ACT值大于400 s。

1.4.2 血液供体的制备 动物麻醉完成后，游离左侧颈外静脉，4-0proline线做荷包缝合。结扎远心端，置入24F静脉插管，接体外循环机静脉管，通过体外循环机连接静脉血槽。游离左侧股动脉， HIS钳夹闭近心端，同理将22F动脉插管置入并固定，接体外循环机动脉管，通过体外循环机连接手术用手套。

1.4.3 离体心脏复跳及后负荷的维持 体外循环机连接完好后，冠状动脉灌注血流。灌注后6例离体心脏中5例自动复跳，1例出现室颤，除颤仪20 J除颤2次后复跳。离体心脏主动脉用3/8软管连接动脉血槽，其后负荷靠两个血槽之间的灌注液形成的压力差(两血槽高度相差80 cm)维持。

1.5观察指标各项指标稳定3 h后开始试验。试验前测定动脉血气及冠状窦口静脉血气，给予不同灌注流量(0.76、1.00、2.00、3.00、4.00 L/min)，待离体心脏血压、心率不再上升后，记录每分钟左冠状动脉前降支血流量(单位为L/min)，抽取5次动脉血和5次冠状静脉血用血气分析仪进行血气分析，准确记录血红蛋白(Hb，单位为g/L)、动脉氧饱和度(AsO2)、静脉氧饱和度(VsO2)，离体心脏的心率、收缩压、平均压、左室收缩压等；再以0.76 L/min流量灌注1 h后重复上述步骤；共3次，取均值。将离体心脏除心室和心房以外的附属物一并去除，将心脏里的血液冲洗干净，并用吸水纸将多余的水分吸净，再次称重并记录(W,单位为g)。

血氧含量(CaO2)=1.39×Hb×(AsO2-VsO2)+0.003×(APO2-VPO2)[5]，其中APO2和VPO2分别为动脉氧分压和静脉氧分压。因实验中测量的是左冠状动脉前降支的血流量，而左冠状动脉前降支仅向33%的心脏供血[6]，故每100 g心肌每分钟耗氧量(MVO2)=100×CaO2÷0.33 W,单位为mL·min-1·(100 g)-1心肌。心肌氧摄取率=(动脉氧含量-静脉氧含量)÷动脉氧含量×100%。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析。采用单因素方差分析对不同灌注流量下离体心脏的MVO2、心肌氧摄取率、心率、收缩压、平均压、左室收缩压等进行比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同灌注流量下离体心脏MVO2及心肌氧摄取率的比较见表1。

表1 不同灌注流量下离体心脏MVO2、心肌氧摄取率的比较

*：与0.76 L/min组比较，P<0.05;#：与1.00和2.00 L/min组比较，P<0.05；△：与3.00 L/min组比较，P<0.05。

2.2不同灌注流量下离体心脏心率、收缩压、平均压及左室收缩压的比较见表2。

1 mmHg=0.133 kPa;*:与0.76 L/min组比较，P<0.05。

3 讨论

3.1移植心脏的保存良好的离体心脏保存是心脏移植成功的保证。保存时间长于4 h会导致心脏不可逆的功能障碍[7]。实践中，用于心脏移植的供体往往来源于另外一个地区，那么提高离体心脏保存时间及质量将有重大意义。Fitton 等[8]改进了灌流装置以保证移植前24 h 心脏不间断的低温灌注，为供体心脏提供了一个有效的保存方法。但高温灌注会引起心肌细胞凋亡，心肌收缩力及冠状动脉流量下降，尤其是41.5 ℃以上高温对离体心脏功能抑制和结构损伤更为明显，且随着温度的升高，抑制和损伤程度加重[9]。低温灌注会引起心率减慢，心舒张期延长，心室舒张末期容积增加，心肌收缩力增强[10]。因此，维持灌注温度恒定至关重要。采用恒温循环器将灌流系统的灌流液及器官浴槽等温度保持在(37.0±0.5) ℃、体外循环下不停跳温血连续灌注的心脏保存方法，能使原位心脏移植后受体猪早期获得更好的心功能及血流动力学稳定[11-13]，减少缺血性损害，提高心脏自动复跳率，能够延长供体保存时限[3]。该研究中作者发现，在恒温状态下，通过监测离体心脏的血压、心率、心肌耗氧量等指标是否上升及上升幅度，可以精确评价离体心脏功能。实验中高灌注流量组离体心脏MVO2、心率、收缩压、平均压、左室收缩压均大于低灌注流量组，证实该方法能够评价离体心脏的功能，可进行心脏移植前供体心脏的筛选。作者还发现，低灌注流量可以减低血细胞破坏几率，离体心脏的血压、心率、MVO2能够随着灌注流量的上升而增加，顺利将心房血液泵出，证明离体心脏功能良好，得到了较好的保存。

3.2该实验模型的优缺点优点：①利用该模型可以评价近似生理状态下离体心脏的功能，可以直接测定离体心脏的心率、血压及心室收缩压，分析其与氧化代谢的关系，而且不受神经、体液的调节，影响因素少，可控性强(如前负荷、后负荷、灌注液成分等均可调节)。②利用该模型可以精确测量动静脉血氧含量，可以精确计算单位质量心肌的耗氧量。③使用的灌流液是供体猪血液和KH液的混合液，更符合猪生理体液，把干扰因素降至最低，显著优越于其他离体心脏灌注模型。④该模型可广泛用于心肌代谢及心功能研究、心功能药物筛选的研究、冠脉扩张药物和心肌耗氧量影响因素的研究等。⑤可为心脏保存的研究提供可靠的离体心脏模型。缺点：①采用大动物作为实验对象，尽管心脏大小和重量近似于健康成人，但受国内科研经费及科研环境的限制，难以广泛开展，至于如何改进、简化实验方法和缩小实验成本，仍需进一步探讨。②因各种条件限制，该实验中作者只监测了6 h，对离体心脏灌注保存上限时间未能给出准确数据。

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(2014-01-20收稿 责任编辑王 曼)

Preservation and cardiac function evaluation of isolated heart from pig in vitro

LIUYang1),LIPanyang2),ZHANGWeihua1),QINGuangqi3),CHENXuemei2),LIAOQiuming3),STEENStig3),QIAOChenhui1)

1)DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofHumanAnatomy，CollegeofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)LaboratoryofLifeandScience,LundUniversity,Lund22594

heart function;heart preservation；isolated heart;pig

Aim: To explore a new pig isolated heart preservation and heart function evaluation method. Methods: A total of 12 Swedish health home pigs were divided into two groups according to blood type, the blood donor group and isolated heart donor group, and 6 in each group. The cardiopulmonary bypass machine were used to perfuse isolated hearts at different perfusion flow(0.76,1.00,2.00,3.00, and 4.00 L/min) under normal temperature (37 ℃). The myocardial oxygen consumption, heart rate, blood pressure and hemodynamic index of isolated hearts were monitored. Results: There were significant differences in myocardial oxygen consumption, heart rate, systolic blood pressure, average pressure, left ventricular systolic blood pressure of isolated hearts with different perfusion flow(F=23.500,331.010,77.701,10.101 and 89.301，P<0.001).The perfusion flow was higher, the indexes mentioned above were higher in isolated heart(P<0.05).There was no statistically significant difference in myocardial oxygen uptake rate among the 5 groups(F=0.426，P=0.788).Conclusion: The method for pig isolated heart preservation and accurate evaluation of cardiac function is established.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.021

R654.2