萝卜硫素对LNCaP细胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表达的影响

朱海鹏

郑州大学第五附属医院泌尿外科 郑州 450052

萝卜硫素对LNCaP细胞增殖、周期、凋亡及IGFBP-3、NF-κB表达的影响

朱海鹏△

郑州大学第五附属医院泌尿外科 郑州 450052

△男，1963年11月生，本科，副主任医师，研究方向：前列腺癌的防治，E-mail:zhuhaipeng081611@163.com

萝卜硫素；前列腺癌；IGFBP-3；NF-κB；LNCaP细胞

目的：观察萝卜硫素(SFN)对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、周期及凋亡的影响以及IGFBP-3及NF-κB在此过程中的变化。方法观察不同浓度SFN对LNCaP细胞增殖的影响后将LNCaP细胞分为4组：对照组、SFN处理组、IGFBP-3 siRNA+SFN处理组以及IGFBP-3 siRNA处理组。MTT法分析各组细胞的增殖情况；流式细胞技术分析各组细胞的细胞周期及凋亡。实时荧光定量PCR技术和Western blot技术分析各组细胞IGFBP-3、NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果随SFN浓度的升高，LNCaP细胞存活率呈下降趋势(F=1 391.781,P<0.001)。IGFBP-3抑制能有效减弱SFN诱导的细胞增殖抑制、G2期抑制与凋亡(F交互=271.130、121.133和95.000,P<0.05)。IGFBP-3抑制可降低SFN处理后IGFBP-3 mRNA和蛋白表达的升高，升高SFN处理后NF-κB mRNA和蛋白表达的降低(F交互=8.595和279.490,P<0.05)。结论SFN对LNCaP细胞的抑制作用可能与IGFBP-3有关，后者可能通过改变NF-κB的表达来发挥作用。

随着人口老龄化及诊断技术的发展，我国前列腺癌的发病率逐年升高[1]。目前针对前列腺癌的药物治疗主要为激素治疗，但是激素治疗存在明显的不良反应，而且在治疗过程中会出现对激素敏感性的丧失，导致无效治疗。萝卜硫素(sulforaphane，SFN)是存在于十字花科植物中的一种异硫氰酸盐。研究[2-3]证实，SFN除具有良好的抗氧化作用外，还具有显著的抗癌作用，可以抑制乳癌、前列腺癌及直肠癌细胞的增殖，其抗癌作用是通过阻滞细胞周期以及诱导细胞凋亡实现。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)是IGFBP家族的成员，可与胰岛素样生长因子特异性结合。研究[4]表明IGFBP-3具有一定的促凋亡作用。NF-κB是一种可诱导的、普遍存在的转录调控因子，它和细胞的生长、黏附、凋亡息息相关。在多种肿瘤细胞中，均存在NF-κB的过表达[5]。作者观察了SFN对LNCaP细胞增殖、周期及凋亡的影响及IGFBP-3、NF-κB表达的变化，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料LNCaP细胞株购自中国科学院上海生命科学研究所。RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)，EntransterTM-R RNA转染试剂(北京英格恩公司)，siRNA序列(上海吉玛公司)，MTT试剂、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Sigma公司)，RIPA裂解液(北京普利莱生物技术公司)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗体、小鼠抗人ACTB多克隆抗体及小鼠抗人多克隆NF-κB p100抗体(Abcam公司)，RNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司)，ImProm-Ⅱ®反转录试剂盒、GO Taq®qPCR Master Mix [普洛麦格(北京)生物技术有限公司]，Dy-Light 800 红外二抗(美国KPL公司)。

1.2细胞培养LNCaP细胞采用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放入37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中进行培养。选取状态良好的对数生长期细胞进行实验。

1.3SFN对LNCaP细胞增殖的影响制备细胞悬液，将对数生长期的LNCaP细胞以1.5×105mL-1的密度接种于96孔板，每孔150 μL。于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后，分别加入终浓度为0、5、10、20、40 μmol/L的SFN，24 h后每孔加入15 μL MTT试剂，继续培养4 h后，小心吸取各孔中的液体，加入100 μL DMSO，置于摇床10 min使其充分溶解。使用酶标仪测定各孔在490 nm处的吸光度。细胞存活率=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。每组设3个复孔，实验重复5次。

1.4细胞分组与处理细胞分为4组：不做任何处理的细胞组(对照组)，经20 μmol/L SFN处理的细胞组(SFN组)，不经SFN处理的IGFBP-3沉默组(siRNA组)，经siRNA处理且经20 μmol/L SFN处理的细胞组(siRNA+SFN组)，以上各组处理24 h后用MTT法检测细胞的存活率。siRNA处理方法为取对数生长期的LNCaP细胞，以1×104孔-1的密度接种于24孔板，每孔加入培养液0.45 mL，37 ℃、体积分数5%CO2培养24 h。使用无血清的RPMI 1640培养基分别稀释siRNA与EntransterTM-R RNA转染试剂，振荡后室温静置30 min以上。吸去24孔板内原有的培养基，每孔加入上述混合液50 μL。加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基0.45 mL,混均继续培养48 h后，使用PCR和Western blot技术验证IGFBP-3在mRNA水平与蛋白水平的沉默效果。每组设3个复孔，实验重复5次。

1.5各组LNCaP细胞细胞周期检测取对数生长期的LNCaP细胞，按1.4中分组处理后继续培养24 h后，收集细胞，使用冰PBS洗涤细胞，用体积分数70%冷乙醇4 ℃固定过夜。PBS洗涤细胞，加入50 mg/L PI 500 μL，4 ℃避光静置30 min。上流式细胞仪分析细胞周期。每组设3个复孔，实验重复5次。

1.6各组LNCaP细胞凋亡检测取对数生长期的LNCaP细胞，按1.4中分组处理后继续培养24 h后，收集细胞，使用冰PBS洗涤细胞，离心后使用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒中提供的含10 mmol/L HEPES/NaOH、140 mmol/L NaCl以及2.5 mmol/L CaCl2的缓冲液500 μL重悬细胞。依次加入5 μL Annexin V以及10 μL PI，常温避光静置10 min后，使用流式细胞仪分析细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复5次。

1.7各组LNCaP细胞IGFBP-3与NF-κBmRNA及蛋白表达水平测定取对数生长期的LNCaP细胞，按1.4中分组处理后继续培养24 h。使用RNA提取试剂盒提取各组细胞的RNA，反转录为cDNA。使用GO Taq®qPCR Master Mix试剂盒对合成的cDNA进行PCR扩增。IGFBP-3(263 bp)上游引物：5’-CAGCCAGCGCGCTACAAGTTGACTA-3’,下游引物：5’-CTGGGACTCAGCACATTGAGGA-3’；NF-κB(482 bp)上游引物：5’-CAAGCGAGGAGGGGACGTG-3’,下游引物：5’-CCCCCAGAGCCTCCACCC-3’；β-actin(186 bp)上游引物： 5’-TGGCACCCAGCACAAT GAA-3’, 下游引物：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3’。反应体系和扩增条件参考试剂盒内说明书。使用2-ΔΔCT法分析各样本IGFBP-3的相对表达情况。实验重复5次。

各组细胞分组处理后，使用RIPA蛋白裂解液(500 μL/孔)提取蛋白样本。将蛋白样本与缓冲液混匀，煮沸5 min后上样，每孔上样量保证为30 μg。电泳后电转至PVDF膜。50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。分别使用小鼠抗人IGFBP-3抗体(按1:500稀释)、小鼠抗人NF-κB抗体(按1:100稀释)与小鼠抗人β-actin抗体(按1:1 000稀释)4 ℃孵育过夜，使用PBST洗涤未结合的一抗。使用Dy-Light 800红外标记的二抗避光孵育膜2 h，使用PBST洗涤除去多余二抗，利用奥德赛远红外成像系统分析蛋白条带。实验重复5次。

1.8统计学处理使用SPSS 18.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同浓度的SFN对LNCaP细胞存活力的影响，采用析因设计的方差分析比较SFN和IGFBP-3 siRNA转染对LNCaP细胞增殖、细胞周期、凋亡及IGFBP-3及NF-κB 表达水平的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度的SFN对LNCaP细胞增殖的影响及各组LNCaP细胞存活率比较0、5、10、20、40 μmol/L的SFN处理24 h后，LNCaP细胞存活率为100%、(85.35±12.68)%、(75.68±18.36)%、(55.63±15.60)%以及(45.66±13.80)% (F=1 391.781,P<0.001)。各组LNCaP细胞存活率见表1。

表1 各组细胞存活率比较(n=5) %

FSFN=1 791.130,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA转染=83.130，P<0.001；F交互=271.130，P<0.001。

2.2各组LNCaP细胞细胞周期比较未经任何处理的对照组，G1期细胞占(70.58±8.25)%，G2期细胞占(5.61±1.23)%，SFN组G2期细胞百分比增至(31.11±9.68)%，G1期细胞下降到(48.66±11.23)%，提示SFN造成了LNCaP细胞的G2期阻滞。IGFBP-3的沉默缓解了SFN引起的G2期阻滞。见表2。

表2 各组细胞G2期比例比较(n=5) %

FSFN=2 148.050,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA转染=120.849，P<0.001；F交互=121.133，P<0.001。

2.3各组LNCaP细胞凋亡率比较见表3。

表3 各组细胞凋亡率比较(n=5) %

FSFN=561.695,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA转染=95.000，P<0.001；F交互=95.000，P<0.001。

2.4各组LNCaP细胞IGFBP-3及NF-κB表达水平比较见表4、5和图1。Western blot分析发现，SFN处理后，IGFBP-3蛋白的表达水平有所提高，NF-κB的表达水平有所下降，而经过siRNA处理后，细胞内的IGFBP-3的表达水平高于对照组，但是低于单纯的SFN处理组。同时,与单纯SFN处理相比，siRNA处理后细胞NF-κB的表达水平下降程度较轻。

表4 各组细胞IGFBP-3 mRNA水平比较(n=5)

FSFN=2 778.307,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA转染=1 424.220，P<0.001；F交互=8.595，P=0.010。

表5 各组细胞NF-κB mRNA水平比较(n=5)

FSFN=3 717.579,P<0.001；FIGFBP-3 siRNA转染=11.236，P=0.004；F交互=279.490，P<0.001。

图1 各组细胞IGFBP-3与NF-κB蛋白的表达

3 讨论

SFN可以通过调节不同的靶分子实现阻滞细胞周期以及诱导细胞凋亡的作用。这能解释该研究中使用SFN处理LNCaP细胞后，出现了细胞增殖抑制、周期阻滞、凋亡率增高等现象。既往研究[6-7]认为SFN诱导的细胞凋亡实际也是依赖于对细胞周期的控制，但这种对细胞周期的控制并不依赖P53这个经典的周期调控分子。该研究结果显示，对于不经SFN处理的LNCaP细胞，IGFBP-3沉默并不影响细胞增殖、周期和凋亡。但是对于SFN处理的细胞，IGFBP-3抑制可拮抗SFN对LNCaP细胞的增殖抑制、G2周期阻滞和诱导细胞凋亡作用，提示SFN可能通过IGFBP-3发挥抗前列腺癌细胞增殖的作用。

IGFBP-3调控细胞增殖的作用已经得到了证实。其机制包括依赖IGF-1途径以及非依赖IGF-1途径。一方面IGFBP-3可以与IGF-1特异性结合，从而使与IGF-1受体结合的IGF-1减少，细胞生长受限，这是一条经典的理论。另一方面，有研究[8]指出，IGFBP-3可与细胞周期调节蛋白作用从而影响细胞周期。此外，IGFBP-3还可与一些凋亡调控因子如MAPK通路的蛋白、Caspase家族、Bax、Bad等作用发挥促凋亡作用[9]。当然也有证据[10]显示，IGFBP-3还可以抑制很多受NF-κB活性调控的因子，如炎性因子等。有研究[11]发现IGFBP-3可通过一种新发现的IGFBP-3受体影响Caspase-3的活性，进而负向调节NF-κB通路。该研究结果显示IGFBP-3抑制可下调SFN处理后IGFBP-3 mRNA和蛋白表达的升高，上调SFN处理后NF-κB mRNA和蛋白表达的降低。

综上所述，SFN能够抑制LNCaP细胞的增殖，其机制涉及IGFBP-3表达水平的变化，SFN可能通过IGFBP-3影响NF-κB通路从而发挥作用。

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(2014-03-20收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of sulforaphane on proliferation, cell cycle and apoptosis of LNCaP and expressions of IGFBP-3 and NF-κB

ZHUHaipeng

DepartmentofUrology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

sulforaphane; prostate cancer; IGFBP-3; NF-κB; LNCaP cell

Aim: To investigate the effects of sulforaphane on proliferation, cell cycle and apoptosis of LNCaP and expressions of IGFBP-3 and NF-κB. Methods: The effects of SFN at different concentrations on LNCaP cells were observed. LNCaP cells were divided into four groups, including control group, 20 μmol/L SFN treated group, IGFBP-3 siRNA+20 μmol/L SFN treated group and IGFBP-3 siRNA treated group. MTT assay was used to evaluate the cell proliferation.Cell cycle arrest and the cell apoptosis were detected by flow cytometry.Further more, the expressions of IGFBP-3 and NF-κB in mRNA level and protein level were analyzed by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.Results: SFN could inhibit the proliferation of LNCaP cells in a dose-dependent manner(F=1 391.781,P<0.001). The inhibition of IGFBP-3 could antagonize the proliferation inhibition, G2phase arrest and apoptosis induced by SFN(Finteraction=271.130,121.133 and 95.000,P<0.05).The inhibition of LNCap could depress the increased expression of IGFBP-3 mRNA and protein after SFN treatment,while increase the reduced expressions of NF-κB mRNA and protein by SFN treatment(Finteraction=8.595，279.490,P<0.05).Conclusion: SNF can inhibit the LNCaP cells′ proliferation and the mechanism may associate with the changes of IGFBP-3, which may play a role in this process by changing the level of NF-κB.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.06.009

R737.25