肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元的表达

朱建忠，刘 冀，王国明，刘建辉，隋月林，石葛明（.沧州医学高等专科学校解剖学和组织胚胎学教研室，河北 沧州 06000；.河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室，河北 石家庄 05007）

·论著·

肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元的表达

朱建忠1，刘 冀1，王国明1，刘建辉1，隋月林1，石葛明2
（1.沧州医学高等专科学校解剖学和组织胚胎学教研室，河北 沧州 061000；2.河北医科大学基础医学研究所神经生物学研究室，河北 石家庄 050017）

目的观察肝硬化大鼠中缝背核一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase，NOS）阳性神经元的改变，推测其在肝硬化所致肝性脑病发病中的作用。方法健康雄性Wistar大鼠模型组、对照组各10只，模型组大鼠经皮下注射CCl4结合饮用酒精14周，应用NADPH-d免疫组织化学法观察中缝背核NOS阳性神经元的改变。结果与对照组相比，模型组大鼠中缝背核NOS阳性神经元数量明显减少、直径变小、染色强度变浅。结论肝硬化影响了大鼠中缝背核NOS阳性神经元。

肝硬化；中缝核；一氧化氮合酶；大鼠

在肝硬化晚期，常因中枢神经系统（central nervous system，CNS）的功能调节紊乱，引起肝性脑病的发生。肝硬化时的门静脉高压，与门静脉系统血流受阻及内脏血流高动力循环有关，导致了血液许多活性物质的代谢失调[1]。有研究[2]发现肝硬化时一氧化氮（nitric oxide，NO）合成增加，暗示NO可能参与了肝性脑病的病理和生理过程，因而受到越来越多的重视。因此，本实验利用NADPH-d免疫组织化学的方法观察肝硬化大鼠中缝背核一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase，NOS）阳性神经元的形态及表达的改变，为肝硬化导致的肝性脑病的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组：健康雄性Wistar大鼠20只购自河北省实验动物中心，体质量150～200g，随机分成2组即模型组（10只）和对照组（10只）。

1.2 肝硬化模型的制备：模型组给予60% CCl4溶液皮下注射结合5%乙醇自来水溶液饮用。首次每只大鼠0.5mL/100g，以后每只0.3mL/100g，每周注射2次，共14周。

1.3 标本制备及染色：所有大鼠经10%水合氯醛（600mg/kg）腹腔注射麻醉后，经左心室灌注固定，取脑后固定4h（4℃）。而后浸30%蔗糖液（0.1mol/L，pH7.4 PBS配制）中至组织块沉底，将所需部位行冠状位冰冻连续切片，片厚40μm，隔4张取1张，间断集片于0.1mol/L，pH7．4 PBS中。染色步骤如下，将切片在0.1mol/L PBS漂洗2次后。浸入孵育液（孵育液组成，0.3%Tritonx-100，1g/L NADPH-Ⅱ，0.5g/L NBT）置于37℃ 60～90min，缓冲液终止反应，裱片制片。

1.4 数据采集：在每只动物的中缝背核处选取5张切片。应用IPP6．0图像分析系统分析对照组和肝硬化组大鼠的NADPH-d阳性神经元的神经元数目以及细胞平均直径和平均光密度值。

2 结 果

在对照组大鼠的中缝背核，多数NOS阳性神经元为蓝色深染，NOS阳性神经元及纤维散在分布于中缝核各部分，中缝背核较为密集，尤其是中缝背核背侧和腹侧神经元数量较多（图1A）；与对照组相比，模型组大鼠中缝背核NOS神经元染色明显变浅（图1B）。与对照组相比，模型组中缝背核NOS阳性神经元数量降低了40.48%（P<0.01），直径降低了13.67%（P<0.05），光密度值降低了66.67%（P<0.01），见表1。

图1 NADPH-d染色结果 （Bar=200μm ×50）

A.对照组;B.模型组

组别数量（个）直径（μm）光密度值对照组47．88±6．1712．42±1．890．042±0．010模型组28．50±4．00#10．72±0．41∗0．014±0．002#

*P<0.05 #P<0.01与对照组比较（t检验）

3 讨 论

NO是以左旋精氨酸（L-argininine，L-Arg）为底物，由NOS催化而成。作为一种神经递质，NO广泛存在于神经系统内，以自由扩散的方式通过细胞膜并激活邻近突触前和突触后的可溶性鸟苷酸环化酶，升高靶细胞内的 cGMP 含量，从而产生一定的生物效应。NOS包括神经元型、内皮源型和诱导型，中枢内的NO合成主要受神经元型NOS的调节，神经元型 NOS的活性直接影响通路中NO的合成，其活性越高，NO的合成越多。正常情况下神经元型 NOS参与突触可塑性和神经元间的信号传递，肝硬化时则表现出神经毒性作用[3]。中缝背核位于中脑导水管腹侧，是中脑神经元型NOS阳性神经元最集中的部位之一[4]。肝功能衰竭时，肝合成蛋白的能力减弱，对体内毒物的解毒能力下降，而肝内外侧支循环的建立导致各种毒素绕过肝直接进入体循环，毒物通过血脑屏障进入神经中枢引发脑病。有研究[5-7]表明，在肝硬化患者和动物血浆中，NO水平明显增高，且与疾病的严重性密切相关。本实验显示，肝硬化大鼠中缝背核NOS阳性神经元与对照组相比数量明显减少、直径变小、染色强度变浅，推测可能在肝硬化时，由于肝脏解毒功能低下，有毒物质进入脑内损伤了中缝背核NOS神经元所致。

综上所述，肝硬化大鼠中缝背核NOS神经元数量减少、体积减小、光密度值降低，提示中缝背核NOS神经元可能参与了肝性脑病的发生。

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（本文编辑：刘斯静）

2013-12-30；

2014-01-16

沧州市科技支撑计划项目（1213141ZD）

朱建忠（1978-），男，河北唐海人，沧州医学高等专科学校讲师，医学硕士，从事人体解剖学教学及科研研究。

R572.2

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1007-3205（2014）05-0559-02

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.020