新型吡唑甲酰胺类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

卢久富,白跃飞,周 鹏,姜 敏,岳思羽,糜桑桑,张 旭,洪晓菲，关旭久

(1.陕西理工学院 化学学院，陕西 汉中 723001；2.东北制药集团股份有限公司，辽宁 沈阳 110027；3.东北制药(沈阳)施德药业有限公司，辽宁 沈阳 110026)

·研究论文·

新型吡唑甲酰胺类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

卢久富1,白跃飞2,周 鹏3,姜 敏1,岳思羽1,糜桑桑3,张 旭3,洪晓菲3，关旭久3

(1.陕西理工学院 化学学院，陕西 汉中 723001；2.东北制药集团股份有限公司，辽宁 沈阳 110027；3.东北制药(沈阳)施德药业有限公司，辽宁 沈阳 110026)

以2-氰基乙酰胺为起始原料，与三乙氧基取代化合物经加成反应制得取代烯酰胺类化合物(3a～3c);3a～3c与芳肼经环合反应得取代吡唑-4-甲酰胺类化合物(5a～5d);5a～5d与酰氯经酰化反应合成了6个新型的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物(7a～7f)，其结构经1H NMR,MS和元素分析表征。抗肿瘤活性测试结果表明，7a～7f对人乳腺癌细胞(A)、人宫颈癌细胞(B)和人肝癌细胞(C)有一定抑制作用，其中3-甲基-5-[4-(甲磺酰胺基)苯甲酰胺]-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)的抑制活性最好，对A,B和C的IC50分别为3.25μM，8.74μM和10.47μM。

2-氰基乙酰胺;吡唑甲酰胺；合成；抗肿瘤活性

临床上应用的抗肿瘤药物种类繁多，其中化疗药物主要有烷化剂铂络合物抗肿瘤药物、葱环类抗肿瘤药物、破坏DNA的抗生素等[1-2]。天然抗肿瘤药物的研究也占有相当大的比例，如目前临床上常用一些药物有喜树碱、长春新碱、紫杉醇等。然而，现有的抗肿瘤药物存在着选择性较差、毒副作用、耐药性等问题[3-4]。寻找高效低毒的抗肿瘤药物仍是科学家面临的重要课题。

本文以2-氰基乙酰胺(1)为起始原料，与三乙氧基取代化合物(2a～2c)经加成反应制得取代烯酰胺类化合物(3a～3c);3a～3c与芳肼(4a,4d)经环合反应制得取代吡唑-4-甲酰胺类化合物(5a～5d);5a～5f与酰氯(6a,6c～6f)经酰化反应合成了6个新型的1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物(7a～7f)，其结构经1H NMR,MS和元素分析表征。并研究了7a～7f对人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞和人肝癌细胞的抗肿瘤活性。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

ARX-300型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Shimadzu GC-MS2010型气质联用仪(GC/EI-MS)。

薄层层析用硅胶GF254，青岛海洋化工厂；柱层析用硅胶，试剂级，160目～200目，安徽良臣硅源材料有限公司；1,泰兴市沃特尔化工厂；乙酸酐，东北制药集团股份有限公司；其余所用试剂均为分析纯，国药集团沈阳化学试剂公司。

1．2 合成

(1)3a～3c的合成(以3a为例)

在反应瓶中依次加入13.36g(39.96mmol)和乙酸酐7mL，搅拌使其溶解；加入1,1,1-三乙氧基乙烷(2a)7.13g(43.95mmol)，于100℃反应过夜。冷却至室温，加入乙醚15mL，过滤，滤饼干燥得白色固体2-氰基-3-乙氧丁基-2-烯胺(3a)3.3g，收率54%，m.p.95℃～97℃；EI-MSm/z: 155.2{[M+H]+}。

用类似方法合成3b～3c。

2-氰基-3-乙氧基-3-甲氧基丙酰胺(3b): 白色粉末，收率61.3%,m.p.81℃～83℃；EI-MSm/z: 171.2{[M+H]+}。

2-氰基-3-乙氧基-3-氟丙酰胺(3c): 类白色粉末，收率57.6%,m.p.94℃～96℃；EI-MSm/z: 159.2{[M+H]+}。

(2)5a～5d的合成(以5a为例)

在反应瓶中依次3a1.0g(6.49mmol)和甲醇15mL，搅拌使其溶解；加入4-氟苯肼(4a)840mg(7.77mmol)，于80℃反应过夜。减压浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1]纯化得黄色固体5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5a)1.0g，收率71%，m.p.92℃～94℃；EI-MSm/z: 217.2{[M+H]+}。

酵母菌：“什么糖我们都喜欢吃。但我说的糖是指糖类，有葡萄糖、果糖、麦芽糖等，还有一些名称里不带‘糖’字的糖，如淀粉等。怎么样，我们爱好广泛吧！”

用类似方法合成5b～5d。

5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5b): 白色固体，收率68.5%,m.p.91℃～93℃；EI-MSm/z: 251.2{[M+H]+}。

5-氨基-1-(4-氟苯基)-3-氟-1H-吡唑-4-甲酰胺(5c): 白色固体，收率59.2%,m.p.87℃～89℃；EI-MSm/z: 239.2{[M+H]+}。

5-氨基-1-苯基-3-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(5d): 白色固体，收率59.2%,m.p.99℃～101℃；EI-MSm/z: 217.2{[M+H]+}。

(3)7a～7f的合成(以7a为例)

在反应瓶中依次加入5a546mg(2.53mmol)和THF 40mL,搅拌使其溶解；加入1-(嘧啶基-4)哌啶-4-酰氯(6a)1.5g(6.70mmol)和叔丁醇钾848mg(7.57mmol)，于室温反应2h。减压浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]纯化得棕色固体N-(4-氨甲酰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5)-1-(嘧啶-4)哌啶-4-咪唑羧基酰胺(7a)0.46g。

7a：收率47%，m.p.115℃～117℃;1H NMRδ：1.30(s,2H),1.64～1.68(m,2H),1.93～1.97(m,2H),2.46(s,3H),2.89(brs,1H),4.15(d,2H),7.10～7.12(m,2H),7.45～7.52(m,5H),8.10～8.13(m,2H)；EI-MSm/z: 405.2{[M+H]+}。

N-[4-甲酰基-1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-5)-1-(吡啶-4)-哌啶-4-甲酰胺(7b)：收率32%，m.p.101℃～103℃;1H NMRδ：1.30(s,2H),1.64～1.68(m,2H),1.93～1.97(m,2H),2.46(s,3H),2.89(brs,1H),4.02(s,3H),4.15(d,2H),7.10～7.12(m,2H),7.45～7.52(m,4H),8.10～8.13(m,2H)；EI-MSm/z: 439.2{[M+H]+}。

5-苯甲酰基-3-氟-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(7c)：收率44%，m.p.144℃～146℃；EI-MSm/z: 343.2{[M+H]+}；Anal.calcd for C17H12N4O2F2: C 59.65,H 3.53,N 16.37；found C 59.60,H 3.51,N 16.30。

1-(氮杂环丁烷-3)-N-(4-羰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5)哌啶-4-甲酰胺(7d)：收率39%，m.p.121℃～123℃;1H NMRδ：1.88～2.05(m,4H),2.48(s,3H),2.63～2.69(m,1H),2.80(t,2H),3.20～3.30(m,2H),4.06～4.12(m,1H),4.26～4.45(m,4H),7.42～7.56(m,5H)；EI-MSm/z: 383.2{[M+H]+}。

N-[4-甲酰基-1-(4-氟苯基)-3-甲氧基-1H-吡唑-5)-1-甲基哌啶-4-甲酰胺(7e)：收率45%，m.p.122℃～124℃;1H NMRδ：1.62～1.65(m,4H),1.98～2.01(m,4H),2.46(s,3H),2.87(brs,1H),4.00(s,3H),4.15(d,2H),7.35～7.52(m,4H)；EI-MSm/z: 685{[M+H]+}。

5-苯甲酰基-3-氟-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)：收率42%，m.p.126℃～128℃;1H NMRδ：2.51(s,3H),3.00(s,3H),7.43～7.51(m,7H),7.56(brs,1H),7.71(s,1H)；EI-MSm/z: 414.2{[M+H]+}。

1．3 抗肿瘤活性测试

采用MTT 法测定7a～7f对人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞和人肝癌细胞的抑制活性，用半数抑制浓度(IC50)表示[3-4]。

以人乳腺癌细胞为例：取0.25%胰蛋白酶消化单层培养的MCF-7细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μL(含3×104～5×104个细胞)。将培养板放入CO2孵箱，于37℃,5%CO2条件下，待培养细胞贴壁后加入不同浓度的待测化合物，每个化合物测试4个浓度[(1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8)mol·L-1]，对照组加入与给药组等体积的溶剂。在CO2孵箱中于37℃，5%CO2条件下培养72h。每孔加入20μL MTT 溶液(5mg·mL-1)，于37℃继续孵育4h，终止培养，弃去孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，轻度振荡10min，选择570nm 波长，用酶标仪测定各孔光吸收值(OD值)，重复测试3次，取平均值，用下式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率，并计算IC50。

2 结果与讨论

2.1 合成

在合成中间体5a～5d时，需严格控制反应温度，如内温超过90℃，TLC显示产生的杂质点异常多，给产品的分离提纯带来极大不便；如内温低于75℃，反应48h后，TLC显示仍有大量原料未反应完全。较佳反应温度为80℃。

2.2 抗肿瘤活性

7a～7f对人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞和人肝癌细胞的抑制活性数据见表1。由表1可见，7f对三种肿瘤细胞显示了最低的抑制浓度；7c稍次之；7a,7b和7d抑制活性较差。由此可以初步判断，当R1为小分子取代基时，Ar和R2分别为小分子苯基和4-氨基取代苯基或4-氟苯基和苯基时有利于提高化合物的抗肿瘤活性。

3 结论

以2-氰基乙酰胺为起始原料，合成了6个1-芳基-3-取代-5-取代氨基-4-吡唑甲酰胺类化合物(7a～7f)。药理活性筛选结果显示，3-甲基-5-[4-(甲磺酰胺基)苯甲酰胺]-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺(7f)对人乳腺癌细胞、人宫颈癌细胞和人肝癌细胞的抑制活性最好，其IC50分别为3.25μM，8.74μM和10.47μM，具有良好的抗肿瘤方面开发应用前景。

表1 7a～7f的抗肿瘤活性*Table1 Antitumor activities of 7a～7f

*MCF-7:人乳腺癌细胞,HeLa:人宫颈癌细胞,BeL7402:人肝癌细胞

[1] 立彦,王自正.pgP介导的肿瘤多药耐药逆转研究进展[J].放射免疫学杂志,2005，18(2):133-134.

[2] 立彦,王自正.化学类抗肿瘤药物的研究进展[J].放射免疫学杂志,2010，41(7):8-11.

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SynthesisandAntitumorActivitiesofNovelPyrazolecarboxamideDerivatives

LU Jiu-fu1，BAI Yue-fei2，ZHOU Peng3，JIANG Min1, YUE Si-yu1, MI Sang-sang3，ZHANG Xu3，HONG Xiao-fei3, GUAN Xu-jiu3

(1.School of Chemistry,Shanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China;2.Northeast Pharmaceutical Group Co.,Ltd,Shenyang 110027,China;3.Northeast Pharmaceutical Group Shi De Pharmaceutical Co.,Ltd,Shen Yang 110026,China)

Three substituted enamide compounds(3a～3c)were prepared by addition reaction of 2-cyanoacetamide with the triethoxyl substituted compounds.Four substituted pyrazole-4-carboxamides(5a～5d)were prepared by cyclization of3a～3cwith phenylhydrazine.Six novel pyrazolecarboxamide derivatives(7a～7f)were synthesized by acylation of5a～5fwith acyl chloride.The structures were characterized by1H NMR,MS and elemental analysis.Antitumor activities were tested against MCF-7(A),Hela(B)and BeL7402(C)cancer cells.The results showed that7a～7fexhibit good inhibitory activity.IC50of 3-Methyl-5-[4-(methylsulfonamido)benzamido]-1-phenyl-1H-pyrazole-4-carboxamide(7f)against A,B and C were 3.25μM，8.74μM and 10.47μM,respectively.

2-cyanoacetamide;pyrazolecarboxamide;synthesis;antitumor activity

2013-06-25;

2014-06-09

陕西省教育厅科学研究项目(12JK0637);陕西理工学院科研计划自组项目(SLGKY12-11)

卢久富(1981-)，男，汉族，辽宁海城人，讲师，主要从事药物合成研究。E-mail: jiufulu@163.com

O626.2；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0612-04