羊水细胞培养用于染色体病产前诊断分析

刘慈 刘义辉 刘学军 王振海 张晓艳 辛虹

·论著·

羊水细胞培养用于染色体病产前诊断分析

刘慈 刘义辉 刘学军 王振海 张晓艳 辛虹

目的探讨羊水细胞培养对孕中期孕妇进行产前诊断的可行性及必要性，防止染色体病患儿的出生。方法对293例有产前诊断指征的孕妇进行羊膜腔穿刺，采取羊水细胞培养，制备中期染色体，分析胎儿核型，进行产前诊断。结果发现染色体异常14例，异常率4.78%，其中数目异常9例，结构异常5例，不同产前诊断指征分组中的异常率不同，以夫妇一方为染色体异常组异常率最高。结论妊娠中期对有产前诊断指征的孕妇进行羊水细胞培养染色体核型分析是产前诊断的重要手段，而血清学筛查，染色体检查和超声检查三者相互结合对于预防出生缺陷意义重大。

染色体；核型；胎儿；羊膜腔穿刺；产前诊断

随着生物医学的发展以及人们对优生优育的高度重视，染色体疾病的产前诊断技术得到了迅速提高，其中包括胎儿羊水、脐血、绒毛细胞培养及荧光原位杂交(FISH)等。羊膜腔穿刺术经多次改进，目前已成为国内外公认的安全、简便、经济的产前诊断取材方法。国内外对染色体病的产前诊断仍以羊水染色体检查为主。本文就河北医科大学第二医院293例产前诊断对象的羊水细胞培养及染色体结果进行分析，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年3月至2012年12月河北医科大学第二医院产科及遗传咨询门诊有产前诊断指征的孕妇，年龄19～46岁，孕周为18～25周，共293例。按照孕妇进行产前检查的首要原因，将孕妇依次分成6类。其中孕妇产前筛查高风险107例，高龄孕妇106例，超声检查提示胎儿异常者47例，夫妇双方一方染色体异常者5例，有21三体或其他染色体病患儿生育史的23例，其他原因者5例(包括孕早期用药史、有害物质接触史等)

1.2 方法 细胞培养：在妊娠18～25周进行羊膜腔穿刺，B超定位即寻找无胎体的最深羊水池位置，常规无菌消毒，在超声实时监测下经腹壁穿刺，抽取羊水20～30 ml，置无菌离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，留取1 ml羊水及沉淀细胞，置于5 ml羊水完全培养基(AminoMAXTM-II Complete，GIBCO)中，37℃ 5%CO2培养箱中培养，一般在第7天换液，先在倒置显微镜下观察，如有多个中小克隆，即可吸出原来培养液加入新培养基5 ml即换液，并将原液加入另一新的培养瓶，继续培养，以备复查。一般换液后再培养24 h即可收获，此时细胞生长旺盛，倒置显微镜下观察，有较多圆形透亮细胞。但由于存在个体差异，个别羊水细胞状态不好的，换液后可培养48 h后再收获。

收获：加入秋水仙素，终浓度为0.1 μg/ml，继续培养5～6 h，镜下观察有大量圆形细胞即可终止培养。用0.25%trypsin-EDTA消化3 min左右，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入0.075 mol/L KCl低渗7 min，并用3∶1甲醇冰醋酸预固定和固定后，滴片，常规G显带。每例计数20～30个分裂相，每例分析5个核型。

2 结果

2.1 不同产前诊断指征中的染色体异常分布 本组检出的14例染色体异常中，高龄组5例占35.71%(5/14)，均为非整倍体；唐氏高危组2例占14.29%(2/14)，其中1例为21-三体，1例为结构异常；不良孕产史(包括21-三体分娩史)组1例占7.14%(1/14)，为染色体结构异常；夫妇一方染色体异常组3例占21.43%(3/14)，均为结构异常；超声检查异常组3例占21.43%(3/14)，均为数目异常。14例染色体异常中，染色体数目异常共9例，其中常染色体数目异常8例(8例47，Xn，+21，1例47，XX，+18)，性染色体数目异常1例(45，XO)，均选择孕中期引产；染色体结构异常5例，均足月分娩，随访表型正常。见表1。

表1 14例染色体异常胎儿相关临床资料

2.2 胎儿染色体异常检出率与不同产前诊断指征的关系 293例孕妇中胎儿染色体异常检出14例，检出率为4.78%。夫妇一方染色体异常组胎儿染色体异常检出率最高，比率达到60%，与高龄组、唐氏高危组、不良孕产史组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；高龄组、唐氏高危组、不良孕产史组和超声检查异常组染色体异常检出率间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同产前诊断指征分组中胎儿染色体异常检出率比较 例

3 讨论

染色体病是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一，可以通过产前诊断预防缺陷儿的出生。由于羊水检查是在孕中期进行，取材操作简单安全、细胞培养相对成功率高，发现异常可及时终止妊娠。

方群等[1]研究发现，具有产前诊断指征的高危孕妇胎儿染色体异常检出率为3.8%～7.7% 。本研究胎儿染色体异常检出率为4.78%，与文献报道相近，均高于一般人群染色体异常发生率0.5%[2]。

3.1 高龄及唐氏筛查高危与胎儿染色体异常的诊断 本研究发现年龄≥35岁的孕妇中发生非整倍体的概率为4.72%(5/106)，而年龄<35岁者则仅为1%[3]。因此对于35岁以上的高龄孕妇，羊膜腔穿刺时一项必不可少的检查。

据报道，胎儿唐氏综合征的发病只有15%～31%是发生在35岁以上孕妇，而69%～85%是发生在小于35岁的孕妇[3]。在我国生育高峰在35岁以下，所以唐氏综合征的血清学筛查也很重要。但目前各个医院所用的筛查指标和筛查软件不尽相同，筛查的假阳性率相当高，假阴性率也时有发生，故迫切需要一种特异性较高的筛查方法。本研究发现，唐氏高危组胎儿染色体异常检出率为1.87% (2/107)，与文献[4]报道的1.3%相近。

本研究中，唐氏高危组发现2例胎儿染色体异常，1例为21-三体，另1例为平衡易位：46,XX,t(2;15)(q13;q15)(生后随访未发现表型异常)。

3.2 B超检查与胎儿染色体异常的诊断 超声检查方法简便、无创、迅速，是产前诊断不可缺少的手段之一。异常超声波对产前诊断意义重大，胎儿外观异常，往往提示胎儿染色体有异常的可能。本文47例超声异常病例中，胎儿染色体异常率为6.38%(3/47)。在检出的3例羊水染色体异常病例中，均有2个或更多部位的发育异常，且均是数目异常47,XX,+18，45,XO，47,XY,+21。胎儿2个或多个部位发育异常较1个部位发育异常更能明显提示胎儿染色体异常，其几率由2%上升至21%[5]。Verdin等[6]报道母体血清筛查阴性的孕妇，胎儿超声波数据异常提示胎儿染色体异常的风险增加，如果超声筛查正常，则胎儿染色体非整倍体的风险减低至0.6%。B超检测不仅与检测仪器相关，B超医生的经验也非常重要。故我们认为对母体血清筛查阴性的孕妇，超声检测胎儿存在2个或多个部位发育异常具有产前诊断意义。

3.3 胎儿染色体异常及其相关的遗传咨询 本研究中夫妇一方染色体异常组胎儿染色体异常检出率最高，该组共有5例，1例丈夫核型为47,XYY，胎儿核型为46,XY，正常分娩；1例丈夫核型为46,XY,t(1;3)(p36;q21)，胎儿核型为46,XX，理论上说平衡易位的父亲有核型完全正常胎儿的几率仅为1/18[7]，故及其幸运，该胎儿正常分娩。其余3例均为父母一方为平衡易位或倒位携带者，胎儿的核型与双亲之一相同，即遗传性平衡易(倒)位。通过羊水穿刺检查确诊的胎儿染色体平衡易位或倒位可以来自遗传或重新组合，故应需对父母双方的染色体核型进行检查。如果胎儿继承父母一方的平衡性结构重组，那么子代的表现型是正常的。但是如果父母双方染色体核型正常，胚胎染色体重组发生在早期的特殊时期，那么对子代造成的影响可能是明显的畸形和智力障碍，风险为8%～10%[8]。本文唐氏高危组1例，父母核型均正常，胎儿核型为46,XX,t(2;15)(q13;q15)，该胎儿的易位为新发生的，其智力低下或表型异常的风险约为10%。鉴于系统超声无结构方面的明显异常，该孕妇坚持继续妊娠。

本研究1例21-三体儿生育史孕妇，于孕19周产前诊断，胎儿核型为46,Xdel(Y)(q11)，丈夫核型为46,XY,Y≈18。经C带证实，胎儿异染色质部分完全丢失，生精基因位于Yq11～12区域及着丝粒附近区域，功能基因是否缺失尚不能确定，所以即使胎儿智力表型正常，其成年后是否有精子生成障碍尚不能确定。鉴于上述情况的遗传咨询，应使孕妇及家属充分知情后决定是否继续妊娠。

综上所述，羊膜腔穿刺术损伤小、安全、易于操作，羊水细胞培养染色体核型分析是产前诊断的常用方法。目前产前筛查、超声诊断和羊水穿刺三者有效地结合是预防出生缺陷的最佳手段。

1 方群，游泽山，王彩玲，等.妊娠中晚期300例胎儿脐血染色体核型分析.中华医学遗传学，2000,17：16-19.

2 侯红英，李小毛，滕奔骑，等.妊娠中晚期羊水细胞核型分析.中国优生与遗传杂志，2006,14：42-44.

3 陆国辉主编.产前遗传病诊断.第1版.广州：广东科技出版社，2002.163.

4 高雪峰，邵敏杰，杨丽萍，等.羊水细胞培养染色体核型分析在产前诊断中的意义.中国优生与遗传杂志，2009,17：45-46.

5 Drummond CL,Gomes DM,Senat MV，et al.Fetal karyotyping after 28 weeks of gestation for late ultrasound findings in a low risk population.Prenat Diagn,2003,23:1068.

6 Verdin SM,Whitlow BJ,Lazanakis M，et al.Ultrasonographic markers for chromosomal abnormalities in women with negative nuchal translucency and second trimester maternal serum biochemisty.Ultras Obst Gynec,2000,16:402.

7 左伋主编.医学遗传学.第5版.北京：人民卫生出版社，2008.179.

8 Warburton D.Outcome of cases of de now structural rearrangements diagnosed at amniocentesis.Prenat Diagn，1984，4:69-80.

Significanceofamnioticfluidcellscultureintheprenataldiagnosisforchromosomaldiseases

LIUCi*,LIUYihui,LIUXuejun*,etal.*TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the feasibility and necessity of amniotic fluid cells culture in the prenatal diagnosis for chromosomal diseases in order to prevent the birth of fetus with chromosomal diseases.MethodsThe 293 specimens of amniotic cell obtained by amniocentesis from 293 pregnant women with prenatal diagnosis indications were cultured and analyzed.ResultsAmong the 293 specimens of amniotic cell,14 cases of chromosome abnormality were found,with the chromosome abnormality rate being 4.78%,including 9 cases of chromosome number abnormality and 5 cases of chromosomal structure abnormality.The chromosome abnormality rates were different in different groups with different prenatal diagnosis indications,in which the chromosome abnormality rates were the highest in the group with one party of the couple with chromosome abnormality.ConclusionThe amniotic cell culture and chromosome karyotype analysis are the effective means in prenatal diagnosis for chromosomal diseases in the pregnant women with prenatal diagnosis indications at mid trimester of pregnancy,moreover,the combined detection of serological screening,chromosome examination and ultrasonic inspection plays an important role in the prevention of child birth defects.

chromosome;karyotype,fetus;amniocentesis;prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.003

050000 石家庄市，河北医科大学第二医院产科(刘慈、刘学军、辛虹)，妇科(王振海)；河北省辛集市第一医院骨科(刘义辉)；河北省遵化市人民医院神经内科(张晓艳)

辛虹，050000 河北医科大学第二医院；

E-mail:xh.hbyd@hotmail.com

R 596.1

A

1002-7386(2014)08-1132-03

2014-01-22)