发光细菌法测定水质急性毒性研究进展

李再兴,尹 青，赵俊娜，李贵霞，刘艳芳，李 伟，高 湘

(1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省污染防治生物技术实验室，河北石家庄 050018)

发光细菌法测定水质急性毒性研究进展

李再兴1,2,尹 青1,2，赵俊娜1,2，李贵霞1,2，刘艳芳1,2，李 伟1,2，高 湘1,2

(1.河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省污染防治生物技术实验室，河北石家庄 050018)

发光细菌法具有简单、有效、快速、重现性好、成本低等特点，已成为水质急性毒性快速检测的首选方法。介绍了发光细菌法的检测原理、常用发光细菌类型及其检测技术的研究进展，综述了发光细菌法在工业废水、城市污水、饮用水、地表水的水质急性毒性检测研究现状，及其在水质污染突发事件的快速应急监测中的应用。分析表明，充分利用发光细菌的自身优势开发出便捷、快速、稳定的水质急性毒性在线检测方法和设备，对水体水质进行在线监测将是发光细菌法的一个研究重点。

发光细菌; 急性毒性; 水质检测

污染水体引起水生生物生理活动不良改变时，即是对这种生物产生了生物毒性。生物毒性根据作用时间的长短分为急性毒性、慢性毒性和遗传毒性。其中急性毒性可以表明污染水体与生物短时间接触后对生物造成的损害[1]。通过建立污染水体作用剂量与毒性效应关系，可以将损害程度量化，直观地反映污染水体对生物种群的影响，提供环境污染预警，更好地指导环境污染防治[2-3]。因此，水质急性毒性检测已经逐步成为评价水质污染的重要手段之一。

急性毒性检测以选取受试生物的不同分为鱼类急性毒性测试法、浮游生物急性毒性测试法和微生物急性毒性测试法[4]。鱼类急性毒性测试法和浮游生物急性毒性测试法可以灵敏而准确地反映水体急性毒性水平，但是这两种方法工作量大，测试时间长，不适于大批量水样的快速检测；发光细菌法因其检测速度快、自动化程度高、人为错误少等优点得到广泛应用。20世纪70年代末，国外科学家从海鱼体表分离出了发光细菌用于检测水体的生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段[5-7]。本文综述了发光细菌法检测水质急性毒性的研究进展，并对发光细菌法在水质检测中的应用前景进行了展望。

1 发光细菌法原理

发光细菌是一类含有lux基因，在正常的生理条件下能够发射可见光的细菌，属革兰氏阴性菌，兼性好氧化能自养型。目前已知的发光细菌有弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)、光杆菌属(Photorhabdus)和致病杆菌属(Xetorhabdus)，均属于γ-朊细菌组[8]，主要分布在海洋中。而霍乱弧菌(Vibriocholera)则是少数被发现的淡水发光细菌之一，中国学者朱文杰从青海湖中分离得到一个淡水发光细菌新种并命名为青海弧菌。

发光细菌在正常生理条件下能发出450～490 nm蓝绿色可见光，在一定的环境条件下发光强度比较稳定。其发光机理为特异性荧光酶(LE)、还原性黄素单核苷酸(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致反应历程如下：

FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCHO→

LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+H2O+RCOOH+光。

发光细菌发光是细菌体内正常生理氧化反应的结果。发光细菌的发光过程极易受到外界条件的影响，凡是干扰细菌呼吸或生理过程的因素均能使细菌发光强度发生改变，这就是发光细菌用于毒性检测的基本原理。培养至正常发光的发光细菌与毒性物质接触后，由于其与发光相关的代谢途径受阻，短时间内即可表现出发光强度减弱，且发光强度的减弱量与毒性物质的浓度呈良好的相关性[9]，可以此来检测物质的急性毒性。

2 发光细菌用于急性毒性检测

1672年BOYLE观察到发光细菌所发出的光易被化学物质抑制，引起科学界对细菌发光效应的大量研究。BULLICH于20世纪70年代提出了水环境急性毒性检测的发光细菌法，率先推出“Microtox Test”，配以发光细菌冻干粉制剂机和专用的测光仪进行水环境急性毒性的测定。此后该方法因其快速、灵敏、重现性好等优点逐步得到推广应用[10]。目前发光细菌用于急性毒性检测包括以下2个层面。

1)发光细菌直接用于急性生物毒性检测

利用发光细菌发光强度与环境中急性毒性物质浓度成负相关的原理，直接将发光细菌与检测样品进行接触，通过监测发光强度的变化，来考察样品的急性毒性水平，这种方法是最常见的发光细菌急性毒性检测方法，BULLICH所推出的“Microtox Test”即属于该层面应用。此类方法因所采用的测试菌种、表征方式和测试仪器的差异而有所不同。目前常用的发光细菌测试菌种为费氏弧菌、明亮发光杆菌和青海弧菌。

美国现行国家标准[11]中推荐采用费氏弧菌作为急性生物毒性的测试菌种。JURADO等以费氏弧菌为测试菌种，检测了烷基聚葡糖苷的急性生物毒性，通过与其他急性生物毒性测试方法的比较，表明采用费氏弧菌作为测试菌种能准确反映该物质的急性生物毒性[12]。中国现行急性生物毒性检测标准[13]中推荐采用的测试菌种为明亮发光杆菌，同样能获得准确的测试结果。费氏弧菌和明亮发光杆菌均属于海洋发光细菌，无法准确反映湖泊、河流等淡水水体的急性生物毒性。因此，一种淡水发光细菌被分离制备为测试菌种，WU等采用其测定上海市高速公路地表径流的急性生物毒性，通过与斑马鱼急性生物毒性检测法进行比较，表明检测结果准确可靠，测试过程简便快速，获得满意效果[14]。

发光细菌法测定水质急性毒性可选用参比毒物浓度来表征，也可选用EC50值(半数效应浓度)来表征。中国国标中采用氯化汞作为参比毒物，在检测样品的同时，制作一系列浓度的氯化汞与发光强度关系曲线。以样品的相对发光强度从标准曲线上查得对应的氯化汞浓度，则该样品的毒性即相当于该浓度氯化汞的毒性。所谓的EC50值是从毒理学的半数致死剂量引申而来的，在此是指使一组受试菌体相对发光强度为50%时的样品的百分比浓度。显然，此值越小，毒性越大。这两种表征方法客观上均对污染水体的毒性大小给出了判断标准。为了更加直观地反映水质的毒性水平，可将毒性进行分级[15-16]，水质急性毒性(发光细菌法)分级见表1。杜丽娜等以GB/T 15441—1995中推荐明亮发光杆菌(PhotobacteriumphosphoreumT3spp．)为测试生物，从数据处理、参比毒物和测定方法3个角度，对国标方法进行了改进。建议采用自身活动性较强的弧菌科菌种替代国标推荐的杆菌。同时讨论了毒性较低的 ZnSO4·7H2O替代标准剧毒性物质氯化汞的可行性[17]。

表1 水质急性毒性(发光细菌法)分级Tab.1 Classification acute toxicity of water quality (luminescent bacteria)

目前国内外市场上已出现了多种发光细菌相关的检测仪器与试剂盒产品，如美国BECHMAN仪器公司的Microtox、SDI公司的Delta Tox，Merck公司的Tox Alert，以及荷兰Skaler公司的ToxTracer等，这些仪器各具特点，但都以发光细菌直接用于急性毒性检测，只是检测过程实现了模块化，使操作更简便、快速和准确，并尽可能地减少了人为干扰[9,18]。

2)基因水平发光细菌急性生物毒性检测

发光细菌直接用于急性毒性检测，能较好地反映物质的综合毒性，但是不能获得不同类型毒性物质的毒性信息，于是人们开始探索重组型发光细菌用于急性毒性检测。重组型发光细菌可以实现对特定毒物的选择性检测，HWANG等将发光细菌基因与各种应激系统的启动子重组之后，构成各种应激型发光细菌测试菌种，如分别对超氧自由基和羟基自由基产生损伤敏感的DS1型和DK1型，将2种应激型发光细菌与银纳米颗粒接触后发现，DS1型的发光强度有明显变化，而DK1型则几乎未发生变化，即可推测出游离Ag+导致大量超氧自由基生成，而未产生羟基自由基[19]。

此外，还可以采用基因重组技术将发光细菌的发光基因重组于某种特殊载体，然后将这种载体进一步固化于特定物质，进而实现毒性物质的实时在线监测。CHO等采用基因工程技术对发光细菌进行基因水平改造后将其冷冻干燥在384微孔板中，再配以生物发光测定仪组成了全自动Microtox毒性检测系统[20]，可实现毒性物质连续性监测，消除人为操作的误差。

3 发光细菌法测定水质急性生物毒性研究进展

20世纪90年代德国与欧盟均颁布了应用发光细菌检测水质急性毒性的标准方法。英国于1999年依据这些标准，颁布了用发光细菌法检测水质的国家标准(British Standard)，实验所用的发光细菌菌种均属于海洋细菌的费氏弧菌。“9·11事件”以后，美国有26个州强制要求应用发光细菌法检测水厂水质。中国于1995年颁布实施了《水质 急性毒性的测定 发光细菌法》(GB/T 15441—1995)，近年来该方法不断发展，已成为中国水质急性毒性快速检测的首选方法。中国2008年颁布的《发酵类制药工业水污染物排放标准》(GB 21903—2008)等6项制药废水排放标准中首次提出了急性毒性水质指标，其推荐检测方法为发光细菌法。

3.1工业废水急性毒性检测

工业废水组成复杂，常规理化指标检测虽然可以对废水中某些污染物进行快速定量但却难以测定其全部污染组分对环境的综合效应。因此，常采用发光细菌法对工业废水进行急性毒性检测，以考察其进入自然水体后可能对水生生物和自然环境造成的冲击。王宾香等采用Microtox技术(发光细菌毒性检测技术)对印染废水中主要污染成分蒽醌染料和偶氮染料及其降解产物进行了急性毒性检测，结果表明，Microtox技术能够快速准确地反映样品的急性毒性水平，与常规理化指标具有相关性[21]。MEKKI等分别采用发光细菌法和细菌生长抑制法对橄榄油磨坊废水处理前后的急性毒性进行了检测，结果表明发光细菌法较细菌生长抑制法测试时间更短，毒性效应敏感性更强[22]。SOMENSI等采用臭氧工艺对纺织制造业废水进行处理，并利用发光细菌法对处理前后的废水急性毒性进行检测，结果表明，采用发光细菌法检测纺织废水能较好地反映处理过程中废水的急性毒性变化，具有灵敏、快速的特点，能够实现废水处理工艺的实时监测[23]。RIBO用发光细菌法对不同时期的工业废水分别进行了急性毒性测定，结果表明，理化分析并不能完全说明工业废水的危害，而发光细菌法则具有较大的优越性[24]。韦昊等采用发光细菌法对某企业PTA废水进行急性毒性测试，结果表明，6个PTA废水样中有3个呈现高毒性，建议化工企业排放PTA废水时应先进行无毒处理，确定无毒后再排放[25]。MAHMOUD等利用发光细菌Vibriofischeri对萨力多胺进行改进发光细菌实验，对其进行了综合毒性评价和定量结构活性关系(QSAR)研究[26]。

从国内外的研究情况可以看出，采用发光细菌法对工业废水进行急性毒性检测与理化分析方法具有相关性，可以实现工业废水急性毒性检测的快速、准确。

3.2城市污水急性毒性检测

城市污水回用是解决水资源短缺的重要措施之一，但是实现污水回用首先要保证回用水的安全性，消除其对人体或环境可能产生的潜在危害，因此需要对城市污水进行急性毒性检测，建立污水处理工艺急性毒性评价与优化体系，实现污水再生回用的安全性。黄满红等分别用发光细菌法、大型水蚤法和微生物氧吸收累计量法3种方法对上海市3家污水处理厂水质进行沿流程急性毒性检测[27]。发现污水经各厂处理后，急性毒性显著降低，出水急性毒性合乎要求。而就3种检测方法的对比来看，利用发光细菌法检测水质急性毒性具有简单、省时、直观的优点，可广泛应用于水处理工艺的评估和优化过程中。王丽莎等采用发光细菌法测定了2个城市污水再生利用示范工程工艺流程中急性毒性的变化，结果表明，二级生物处理能显著降低污水的急性毒性，但氯消毒显著提高了污水的急性毒性，并且脱氯后污水的急性毒性仍保持较高的水平，对生态安全造成了潜在威胁[28]。马晓妍等应用青海弧菌Q67对氧化沟处理工艺各处理单元和进、出水的生物急性毒性进行检测，结果表明，水样取回后立即进行发光细菌毒性实验，水样均显示为刺激发光效应，污水毒性被掩盖；将污水用微滤膜过滤可以使水样的生物毒性更好地显现，提高了毒性检测结果的真实性和准确性[29]。

发光细菌因其良好的毒物响应特性，可用作城市污水处理过程中急性毒性检测受试生物。发光细菌急性毒性检测法可为污水处理过程中的水质安全提供技术保证。

3.3饮用水急性毒性检测

目前，由于农、兽药残留、有机污染物污染、食品添加剂以及生物污染等引起的饮用水安全问题时有发生，饮用水安全问题成为社会各界关注的焦点。欧美许多国家和地区均将发光细菌法广泛应用于饮用水系统的安全和应急评估。中国2008年奥运会及2010年上海世博会期间均采用发光细菌法监测饮用水的安全性。潘海祥等利用发光细菌法对宁波供水体系中的7个主要水源、5个水厂出水及相应的管网水2次/月连续进行了急性毒性监测，结果表明发光细菌法因其快速、准确的特点可用于饮用水系统的毒性监测及预警[30]。张亚旦等用青海弧菌Q67对生活饮用水卫生标准中规定限制检出的14种物质配制的混合液进行了检测，结果表明，该混合液对发光细菌有明显的抑制作用，虽然单一物质浓度均在安全限制浓度以下，但其综合毒性十分明显，可能对生物和人造成严重影响[31]。康莉等采用发光细菌法对某地区饮用水的综合毒性进行了分析，结果表明，该地区水质生物毒理性基线为-11%～18.4%，pH值、色度、浑浊度、余氯等因素对发光细菌发光有抑制作用，需要在测试之前对水样进行预处理[32]。通过建立生物毒理性基线，发光细菌法可以快速地判定水样的毒性强弱，可作为监测水质突发性污染事故及水质突变的应急方案。

发光细菌急性毒性检测法因其结果的可靠性、操作的简便性以及成本的合理性已成为饮用水水质常规监测的有效手段，其中比较常用的是Microtox检测系统，已有多个国家将该系统应用于饮用水的监测。

3.4地表水急性毒性检测

近年来，地表水系受到工、农业污水的影响，水质持续恶化。由于地表水体中的污染物种类复杂，难以用单一的理化指标来表示其污染程度。因此需要通过急性毒性试验，考察水体的污染负荷与生物效应的关系，以便综合评价地表水水体污染现状。发光细菌法因其独特的优势，在地表水水质评价方面具有较好的可行性。KUCZYNSKA等将化学分析法与发光细菌法相结合评价了离城市垃圾堆较近的地表水水体的急性毒性，结果表明，化学分析法只能检测某一种或某一类物质的存在状态或水平，并不能准确反映地表水体的受污染程度对水生生物造成的危害，而发光细菌法可以直观地反映地表水污染程度对生物造成的损害[33]。ELTZOV等将发光细菌固定在光纤上制成水中毒性污染物在线监测仪，用以检测地表水中的遗传毒性物质，取得了良好的效果[34]。

3.5水质污染突发事件的快速应急监测

近年来吉林松花江、河北大沙河、无锡太湖等地陆续发生恶性水质污染事件，严重影响了经济和社会的正常活动。为保障供水安全，需要建立快速、准确的急性毒性监测方法，以生物传感器为基础的全自动Microtox毒性检测系统应运而生。CHO等发明的全自动Microtox毒性检测系统用连续的苯酚溶液和废水测试时发现，细菌暴露于水样后发光强度急速下降，1 min后即可达到仪器检出限，通过生物发光测定仪对其进行检测后即可给出监测结果，该系统满足水质24 h全自动实时监测的要求[20]。张理兵等以明亮发光杆菌为指示生物，采用光纤作为细菌发光信号传导介质，研究出一种用于重金属检测的光纤传感器，使识别元件与光学检测分析部分相分离，便于现场检测应用，且该传感器与传统检测方法具有很好的相关性[35]。

基于发光细菌法的生物毒性在线监测仪器以其可靠的评价方法、高效的检测能力和便捷的操作方式等优点，已被越来越多地应用在水质污染突发事件的快速应急监测中。

3.6其他方面的应用

目前发光细菌法在水质综合毒性监测方面的应用十分广泛，除以上几个方面外，还在废渣浸出液、纳米材料、持久性有机物及重金属等的生物毒性研究方面都有所应用。

曾理等采用发光细菌法对金矿矿区农田周边堆存的废渣浸出液及矿区农田灌溉用水的生物毒性进行了研究，结果表明，所有矿区样品浸出液及水体中的Cd均超出地表水质量Ⅲ类限值和农田灌溉水质标准，矿区上游地表水和下游废水中CN-含量超出地表水质量Ⅳ类限值[36]。隆异娟等采用发光细菌法考察了硫化镉纳米材料的形状对毒性的影响，结果表明，硫化镉纳米材料的毒性差异与其形状有关，其原因可能是不同形状的纳米粒子对细胞膜具有不同的刺伤能力[37]。KATRITZKY等用多重线性回归建立了一组持久性有机污染物毒性与其浓度的定量构效关系[38]。张海凤等采用发光细菌法对5种铸造废砂中的重金属与有机污染物的生物效应进行了研究，结果表明，5种废砂中的有机污染物种类十分复杂，对发光细菌表现出不同程度的抑菌活性，发光强度的抑制率为30%～95%[39]。

朱丽娜等采用发光细菌法对中国《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)和《污水综合排放标准》(GB 8978—1996)中各重金属限值的毒理学安全性进行了毒性等级评价，为上述标准的修订完善提供了技术参考[40]。

4 展 望

发光细菌法检测水质急性毒性，具有灵敏、快速、准确、自动化程度高、人为错误少等优点，其测试结果与理化分析方法和传统的鱼类急性毒性测试法等其他急性毒性测试法的结果具有良好的相关性。利用该方法能够实现水质的实时在线监测和水体污染突发事件的快速响应。但是发光细菌作为一种原核生物，并不能完全真实地反映污染水体对所有生物的急性毒性效应，这给发光细菌法的应用带来一些不可避免的缺陷。尽管如此，发光细菌法经过多年的发展，已经成为一种有效的检测水质急性毒性的方法。今后，对水体进行连续性急性毒性监测将成为水质监测的重点，利用发光细菌自身的优势开发便捷、快速、低成本的急性毒性在线监测方法和检测设备，成为水环境保护工作中的必要环节。

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Advance in the application of luminescent bacteria on detecting acute toxicity of water

LI Zaixing1,2, YIN Qing1,2, ZHAO Junna1,2, LI Guixia1,2, LIU Yanfang1,2, LI Wei1,2, GAO Xiang1,2

(1. School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China; 2.Pollution Prevention Biotechnology Laboratory of Hebei Province, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

The simple, useful, rapid, reproducibility and inexpensive luminescent bacteria toxicity test had become the preferred method for acute toxicity testing of water quality. Detection principle of luminescent bacteria toxicity test, common types of luminescent bacteria, and advances in detection technology of luminescent bacteria toxicity test were introduced in this paper. In addition, acute toxicity testing of water quality research status for industrial wastewater, municipal wastewater, drinking water and surface water, and its applications in the monitoring of water pollution rapid response in emergencies of luminescent bacteria toxicity test were also reviewed.The results show that a convenient，rapid and stable online acute water toxicity testing methods and equipments for water quality monitoring，which are developed by full using of the advantages of luminescent bacteria，will be a research focus of luminescent bacteria toxicity test in the future.

luminescent bacteria; acute toxicity; water detecting

2014-03-17；

2014-05-30；责任编辑：王海云

河北省重大技术创新项目(12276703Z)

李再兴(1973-)，男，四川安岳人，教授，博士，主要从事水污染控制及污染资源化方面的研究。

E-mail：li_zaixing@163.com

1008-1542(2014)05-0480-07

10.7535/hbkd.2014yx05012

X703

A

李再兴,尹 青，赵俊娜，等.发光细菌法测定水质急性毒性研究进展[J].河北科技大学学报,2014,35(5):480-486.

LI Zaixing,YIN Qing,ZHAO Junna,et al.Advance in the application of luminescent bacteria on detecting acute toxicity of water[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(5):480-486.