响应面法酶解剩余活性污泥中微生物蛋白质研究

赵向阳, 王 茜， 陈晓刚， 陈 忻*， 陈小辉， 何绮桦

(1.佛山市水业集团有限公司,佛山 528000；2.佛山科学技术学院化学与化工系，佛山 528000)

活性污泥法是目前应用最广泛的污水处理方法之一，具有效率高、占地少等优点.剩余活性污泥是活性污泥流程中经二沉池沉淀后排除的部分活性污泥，由于含水率高、有恶臭，且含有毒化学物质和病原微生物，若不加以控制，势必造成第二次污染[1-2].目前主要控制手段包括剩余活性污泥的减量化、无害化处理以及资源化再利用.具体包括：大海投弃、土地填埋、焚烧处理和土地利用[3].但是大海投弃对海洋生态系统和人类食物链构成威胁；土地填埋占用大量土地，对环境造成二次污染；焚烧处理形成大量含有重金属和毒性有机物的烟雾而污染大气，且处理费用昂贵；若将污泥作为有机肥料资源长期施用于土地，污泥中的重金属离子、有毒有机物会积累并影响人体健康.

从资源化方向上来说，剩余活性污泥中含大量的微生物单细胞蛋白质[4-6]，分解后可以制备价值高、用途广的中间原料[7-8]，达到减量化、无害化、资源化的目的.而从活性污泥中分解蛋白质作为中间原料的研究方法主要有酸水解法、碱水解法、超声波辅助法和酶解法[9].前3种方法在实际生产中，存在反应条件剧烈、对设备的要求高、对环境容易造成严重污染等问题.而利用酶解法水解污泥蛋白具有反应条件温和、酶解效率高、反应物(蛋白酶)及产物易降解，不会对环境造成二次污染的特点，但目前相关的研究报道较少[9].

响应面分析法(Response SurfaceMethodology,简称RSM)是由一组数学和统计学方法组成，可用于一个或多个响应值与几种因素之间的关系，确定各因素及其交互作用在加工过程中对非独立变量的影响，给出一个数学模型，精确地表述因素和响应值之间的关系，同时可根据数学模型控制响应值，选择不同的操作参数[10].目前利用响应面分析法的研究主要集中在优化工艺条件，对回归方程、等值线、响应曲线的分析应用相对还较少[11].

本研究以剩余活性污泥为原料，探讨蛋白酶的种类、体系温度、酶解时间、酶用量、液固比、体系pH等因素对污泥蛋白质分解率的影响及变化规律后采用响应面分析法研究最佳工艺条件，以期为剩余活性污泥资源化利用提供基础研究数据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料 经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥，由佛山市水业集团镇安污水处理厂提供，平均含水率为41.71%.

1.1.2 主要仪器 SHZ-82A 恒温水浴振荡器：金坛市富华仪器有限公司；pHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；FA2004N 电子天平：上海精密科学仪器有限公司；KDN-102C 型定氮仪：上海纤检仪器有限公司；SYC-15 超级恒温水浴：南京桑力电子设备厂；电炉：中国广州电子瓦礃厂；800B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；85-Z恒温磁力搅拌器：常州市国华仪器厂；ZK-82B真空干燥箱：上海实验仪器总厂.

1.1.3 主要试剂 酸性蛋白酶(3×105U/g) 国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶(1.5×105U/g)：诺维信(中国)生物技术有限公司；木瓜蛋白酶(3×105U/g)：东莞市华琪生物科技有限公司；碱性蛋白酶(2×105U/g)：南宁庞博生物工程有限公司；硫酸铜为化学纯,硫酸钾、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、硼酸、甲基红、溴甲酚绿都为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 剩余活性污泥中微生物蛋白质的酶水解提取的工艺流程(图1)

图1 剩余活性污泥中微生物蛋白质的酶水解工艺流程图

Figure 1 Enzymatic hydrolysis process of microbial protein in residual activated sludge

1.2.2 蛋白酶的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的剩余活性污泥，根据购买时厂家提供各种酶适用的pH范围，按照表1酶解条件设计实验.

表1 酶解条件设计表Table 1 Conditions of enzymatic hydrolysis

酶解后在100 ℃下灭活15 min，在转速4 000 r/min下离心15 min，用凯氏定氮法测定上清液的蛋白质含量，并比较各种酶的分解率.

1.2.3 蛋白质含量的测定 根据GB 5009.5-2010， 粗蛋白含量的测定采用半微量凯氏定氮法进行.计算方法如下：

(1)

式中：X为试样中蛋白质的含量(g/100 g)；V1为硫酸标准滴定液的体积(mL)；V2为试剂空白消耗硫酸标准滴定液的体积(mL)；V3为吸取消化液的体积(mL)；c为硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度(mol/L)；0.014 0为1.0 mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]相当的氮的质量(g)；m为试样的质量(g)；F为氮换算为蛋白质的系数6.25.

1.2.4 蛋白质分解率的测定 蛋白质分解率PEE(%)按式(2)进行计算：

(2)

1.2.5 单因素实验

(1)体系pH的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去离子水，配制成污泥料液，并分别调节体系pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；向预处理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定温度55 ℃下，连续搅拌4.0 h.反应结束后计算提取液中蛋白质的分解率.

(2)液固比的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥5份，分别按液固比3.0∶1.0、3.5∶1.0、4.0∶1.0、4.5∶1.0、5.0∶1.0、5.5∶1.0，加入去离子水，配制成污泥料液，并调节体系pH为7.0；向预处理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定温度55 ℃下，连续搅拌4.0 h.反应结束后计算提取液中蛋白质的分解率.

(3)酶解时间的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去离子水，配制成污泥料液，并调节体系pH为7.0；向预处理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定温度55 ℃下，连续搅拌1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h.反应结束后计算提取液中蛋白质的分解率.

(4)酶用量的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去离子水，配制成污泥料液，并调节体系pH为7.0；向预处理好的污泥料液中分别加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的木瓜蛋白酶，在恒定温度55 ℃下，连续搅拌4.0 h.反应结束后计算提取液中蛋白质的分解率.

(5)酶解温度的选择 称取2.5 g经过消化、脱水的新鲜剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去离子水，配制成污泥料液，并调节体系pH为7.0；向预处理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，分别在恒定温度45、50、55、60、65、70 ℃下，连续搅拌4.0 h.反应结束后计算提取液中蛋白质的分解率.

2 结果与讨论

2.1 4种不同酶酶解剩余活性污泥中蛋白质的作用

结果表明，利用木瓜蛋白酶进行酶解剩余活性污泥中的微生物蛋白质，分解率最高(图2)，其次是碱性蛋白酶，其他蛋白酶的提取效果较差，选取木瓜蛋白酶用于后续实验.

图2 4种酶酶解剩余活性污泥中的蛋白质

Figure 2 Enzymatic hydrolysis results by four different enzymes

2.2 影响酶解法的因素

随着污泥料液体系pH值的增大，木瓜蛋白酶对剩余活性污泥中蛋白质分解率相应的增大，当体系pH为7.0时，蛋白质分解率最高(图3A).

随着液固比的增大，蛋白质分解率相应的增大，当液固比在4.0∶1.0的时，蛋白质分解率最大(图3B).

酶解时间为1.0～4.0 h时，蛋白质分解率随着时间增加而增大(图3C)，在4.0 h后随酶解时间的延长，蛋白质分解率增幅不大.因此确定酶解时间为4.0 h，并把酶解时间2.0～6.0 h作为响应面法的考察范围.

在剩余活性污泥中加大酶用量，蛋白质分解率增加，当酶用量在3.0%时蛋白质分解率达到最大(图3D).因此确定把酶用量2.0%～4.0%作为响应面法的考察范围.

随着酶解温度的升高，蛋白质分解率增大，酶解温度在55 ℃时木瓜蛋白酶的蛋白质分解率最高(图3E)，因此确定酶解温度55 ℃，并把酶解温度45～65 ℃作为响应面法的考察范围.

2.3 酶解的响应面设计分析

采用木瓜蛋白酶进行酶解，在pH为7.0，液固比为4.0∶1.0的条件下，以酶解时间(Y1)为(2.0～6.0 h)、酶解温度(Y2)(45～65 ℃)和酶(E)与底物(S)质量比E/S(Y3)(1.0∶100～3.0∶100)3个主要因素，建立回归模型，对蛋白质分解率进行预测.剩余活性污泥中微生物蛋白质分解率与各因素之间的相互关系式用三元二次多项式预测:

(3)

方程中，Y1、Y2和Y3是自变量，a0,…,a9为回归系数，建立的回归模型是否与实际情况拟合是由R2决定系数与方差分析共同评价的.

2.3.1 回归模型的建立 根据二次正交旋转组合试验设计的原理，本试验所确定的原变量与编码变量之间的关系见表2.三因素二次正交旋转组合设计结构矩阵见表3.

图3 体系不同影响因素对蛋白质分解率的影响

Figure 3 The influences of different effectors on protein extraction rate

表2试验因素水平编码值表

Table 2 Coded values and corresponding actual values of optimization parameters

由表3发现，变量Y1的取值范围为2.0≤Y1≤6.0，变量Y2的取值范围为45≤Y2≤65，变量Y3的取值范围为1.0≤Y3≤3.0，变量Y1、Y2、Y3三者的取值范围相差较大，因此需要先进行归一化处理，即X1=Y1/2，X2=Y2/20，X3=Y3.

利用SAS 9.0软件对表3进行处理，得到了剩余活性污泥中微生物蛋白质分解率PEE(Y)与各因素之间的相互关系式.

Y=-106.94+41.42X1+103.75X2-17.659X3-

10.53X1X3+19.95X2X3.

(4)

由表4可知，酶解时间极差达16.5，说明酶解时间对蛋白质分解率的影响最大，取水平0为最好，即酶解时间4.0 h；酶解温度极差达为6.96，对蛋白质分解率的影响仅此于酶解时间，其中取水平0时，即酶解温度55 ℃；对于酶用量，其极差较少，取水平2为最好，即酶用量3.0%.

2.3.2 回归模型的分析 表5为响应面的二次模型方差分析，表6是二次回归模型的参数.从表5中可以看出模型F值为27.30，P<0.05，表明总体上模型因素水平项显著.回归方程的拟合度是92.47% (R2=0.924 7)，即由二次正交旋转组合试验设计所获得的回归方程与实际情况拟合较好.

2.3.3 酶解时间与酶解温度对蛋白质分解率的影响 在E∶S为3.0%的条件下，应用Design Expert软件对酶解时间与酶解温度的回归模型进行分析.从图4来看，随着温度的升高，在剩余活性污泥中蛋白质分解率呈上升趋势，但当温度上升至58 ℃时，蛋白质分解率开始下降.酶解时间从2.0～5.0 h过程中，蛋白质分解率呈持续上升趋势，4.8 h达到最大值，之后呈下降趋势.

2.3.4 酶解时间与E∶S对蛋白质分解率的影响 在酶解温度为55 ℃的条件下，应用Design Expert软件对酶解时间和E∶S的回归模型进行分析.从图5来看，当E∶S在1.0%～3.0%过程中，蛋白质分解率呈上升趋势，E∶S在2.8%左右，蛋白质分解率最高.酶解温度在45～60 ℃时，蛋白质分解率持续升高，酶解温度在58 ℃的时候达到最大值.

表3二次正交旋转组合试验方案与结果

Table 3 Quadratic orthogonal rotation combination design and results

NO设计矩阵试验方案Y1Y2Y3Y1/hY2/℃Y3/%PEEY/%1-2-2-22.0451.029.83 2-2-1-12.0501.531.23 3-2002.0552.032.25 4-2112.0602.529.45 5-2222.0653.028.05 6-1-1-23.0501.039.77 7-10-13.0551.540.16 8-1103.0602.034.42 9-1213.0652.532.32 10-1-223.0453.039.77 1100-24.0551.049.34 1201-14.0601.543.34 130204.0652.041.72 140-214.0452.548.76 150-124.0503.050.16 1611-25.0601.043.03 1712-15.0651.537.93 181-205.0452.046.05 191-115.0502.540.79 201025.0553.043.34 2122-26.0651.031.42 222-2-16.0451.536.97 232-106.0502.038.75 242016.0552.541.18 252126.0603.036.72 2600-24.0551.049.34 2700-14.0551.551.89 280004.0552.052.08 290014.0552.553.06 300024.0553.053.29

表4 正交试验的极差分析Table 4 Range analysis of orthogonal test

表5 回归方程的方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation

表6 二次回归模型参数Table 6 Quadratic regression model parameters

2.3.5 酶解温度与E∶S对蛋白质分解率的影响 在固定酶解时间为4.0 h的情况下，应用Design Expert软件对回归模型进行分析，由图6可知酶用量在3.0%左右分解率较高，约在55 ℃时蛋白质的分解率达到最大值.

2.3.6 酶解最优工艺参数的确定 由表3、表4及归一化分析可知，当X1=2.0；X2=2.75；X3=3.0时，蛋白质分解率最高.对响应面结果利用软件进行优化分析，为了使Y取得最大值，需使得Y关于X1,X2,X3的一阶偏导数为零. 对式(4)

Y=-106.941 96+41.417 08X1+103.749 12X2-

19.953 57X2X3

求导：

并分别把X2=2.75、X3=3.0，X1=2.0、X3=3.0，X1=2.0、X2=2.75代入(5)～(7),求解得

图4 酶解温度与酶解时间对蛋白质分解率的影响

Figure 4 The influences of enzymatic hydrolysis temperature and time on protein extraction rate

图5 酶解时间与E∶S对蛋白质分解率的影响

图6 酶解温度与E∶S对蛋白质分解率的影响

X1=1.9，X2=2.9，X3=2.4.由此可得出3组最优解，即最优提取工艺条件如下：

第一组：X1=1.9，X2=2.75，X3=3.0.

第二组：X1=2.0，X2=2.9，X3=3.0.

第三组：X1=2.0，X2=2.75，X3=2.4.

把以上3组结果分别代入式(4)，得Y值分别为：52.55%,52.82%,53.53%.

2.3.7 回归模型的检验 为进一步验证该回归模型是否对提取剩余活性污泥中微生物蛋白质工艺具有预测及控制的作用.利用3组酶解条件：X1=1.9,X2=2.75，X3=3.0；X1=2.0，X2=2.9,X3=3.0；X1=2.0，X2=2.75，X3=2.4分别对剩余活性污泥进行酶解(表7)，实际测定的蛋白质分解率与由回归模型计算所得值的蛋白质分解率非常相近，这充分反映出该模型具有强大的分析能力，可为实际操作提供良好的指导.

表7 验证实验结果Table 7 Results of validation experiment

3 结论

采用酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对活性污泥进行酶解，确定木瓜蛋白酶的蛋白质分解率最高，其次是碱性蛋白酶，其他蛋白酶的提取效果较差.

通过二次正交旋转回归设计实验，并利用SAS软件得到木瓜蛋白酶对剩余活性污泥中蛋白质分解率与酶解时间、酶解温度、酶用量的回归模型，该回归模型的拟合优度达92.47%，回归模型与实际情况较为相近.

采用响应面分析法对酶解法提取剩余活性污泥中微生物蛋白质工艺进行优化，最优工艺条件为：液固比4.0∶1.0，pH 7.0，酶解时间为4.0 h，酶解温度约为58 ℃，E∶S约为3.0%，蛋白质分解率可达到53.29%，该值与响应面模型预测值52.82%非常接近，说明响应面模型可以很好的应用于酶解工艺条件的优化.

本文在设计回归模型时，只考虑了酶解时间、酶解温度、E∶S 3个因素对蛋白质分解率的影响，对于液固比、体系pH值等因素对蛋白质分解率的影响，以及酶解的机理探究等有待深入研究.

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