基于还原氧化石墨烯/普鲁士蓝-壳聚糖纳米复合物的高灵敏葡萄糖生物传感器研究

赵海艳，王贝贝，李献锐，任聚杰，籍雪平

(1.河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050017；2.河北科技大学理学院，河北石家庄 050018)

基于还原氧化石墨烯/普鲁士蓝-壳聚糖纳米复合物的高灵敏葡萄糖生物传感器研究

赵海艳1，王贝贝1，李献锐1，任聚杰2，籍雪平1

(1.河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050017；2.河北科技大学理学院，河北石家庄 050018)

在电沉积制备普鲁士蓝-壳聚糖(PB-CS)膜修饰金电极的基础上，引入新型纳米材料还原氧化石墨烯(RGO)，固定葡萄糖氧化酶(GOD)，构建基于RGO/PB-CS纳米复合材料的葡萄糖生物传感器。结果表明，由于RGO独特的物理化学性质以及RGO与PB之间的协同作用，大大提高了此传感器的工作性能。在0.0 V工作电位下，该传感器具有较高的灵敏度(65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2)和较低的检测限(6 μmol/L)。传感器具有较小的表观米氏常数(1.43 mmol/L)，表明该固定酶对葡萄糖具有较高的亲和力。

还原氧化石墨烯；普鲁士蓝；壳聚糖；葡萄糖氧化酶；生物传感器

石墨烯，仅有一个碳原子厚度，是由sp2杂化碳原子紧密堆积成的二维蜂窝状晶格结构，由于其无可比拟的优良性能，在生物传感器及电化学领域具有广阔的应用前景[1-2]。还原氧化石墨烯(RGO)包含一些特征性官能团，例如—OH和—COOH，这些官能团有利于RGO和其他纳米材料形成纳米复合材料。

最近，越来越多的研究者致力于基于RGO纳米复合材料的电化学生物传感器研究[3]，RGO能够与不同的纳米材料产生协同作用，从而增强电化学催化活性，改善传感器的灵敏度[4]。壳聚糖(CS)作为一种天然多糖，含有大量的—NH2和—OH官能团，具有良好的成膜能力、生物兼容性和生物可降解性，对蛋白质有良好的亲和性，有利于保持酶的活性[5]。普鲁士蓝(PB)是一种典型的铁氰化物，能够在较低电位下选择性电化学还原过氧化氢[6]。PB-RGO纳米复合材料曾被用来构建一种新型的电流型生物传感器[6]，然而，PB在电极表面容易渗漏，且在中性和碱性溶液中不稳定。为了克服这一缺陷，科研工作者将PB与一些高分子聚合物相结合，从而改善传感器的工作性能[5,7]。但是传统制备PB的方法操作复杂、耗时长，且PB纳米粒子在较长时间下不稳定。因此，有必要探索一种新方法，将PB和RGO有效结合形成稳定的纳米复合材料，用于电极修饰，以改善生物传感器的稳定性和灵敏度。

本研究中，将PB和CS同时电沉积到金电极表面，然后将RGO分散液滴加到PB-CS修饰的电极表面，形成PB-RGO纳米复合物，为葡萄糖氧化酶(GOD)的吸附提供了较大的比表面积；同时由于PB-CS与RGO之间的协同作用，使得该生物传感器具有较高的灵敏度。CS的引入，改善了传统纯PB膜修饰电极的不足，获得了能在中性及弱碱性条件下使用的修饰电极，为酶的固定化创造一个适宜的微环境，提高了传感器的稳定性。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

CHI750 电化学工作站(上海辰华仪器公司提供)；79HW-1恒温加热磁力搅拌器(江苏荣华仪器制造有限公司提供)；DV215CD精密电子天平(OHAUS 公司提供)；KQ2200DE超声波清洗器(昆明超声仪器有限公司提供)；冷场发射扫描电子显微镜(S-4800，产地为日本)；T1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司提供)；X射线衍射仪(XRD，D/MAX-2500，产地为日本)。

葡萄糖氧化酶(GOD，Sigma公司提供)；石墨粉(光谱纯，国药集团化学试剂有限公司提供)；葡萄糖(分析纯，中国天津凯通化学试剂厂提供)；其他试剂均为分析纯；实验用水为高纯水。

1.2石墨烯的制备

采用Hummers and Offeman法[8]制备氧化石墨烯，通过文献报道方法[9]将制备的氧化石墨烯还原成RGO。本实验通过紫外光谱扫描技术和X射线衍射对氧化石墨烯和石墨烯进行表征，证明了石墨烯的成功制备。

1.3酶电极制备

依次用1.0，0.3和0.05 μm的Al2O3粉将金电极抛光成镜面，用蒸馏水超声清洗。随后把电极依次置于丙酮、Piranha 溶液 (V(H2SO4) ∶V(H2O2)=3∶1) 中超声。用水清洗后，晾干。将处理干净的金电极置于0.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5 mmol/L FeCl3+体积分数为0.01%的 CS(含0.1 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl)的混合溶液中，以20 mV/s的扫速在电位范围-0.1～0.45 V内循环伏安扫描10圈，室温下晾干。然后在电极表面滴加5 μL上述制备的RGO分散液，室温晾干后再滴加5 μL质量浓度为10 mg/mL的 GOD，于4 ℃晾干，滴加5 μL CS溶液，用 0.25%(体积分数)戊二醛交联20 min。然后用水清洗，得到CS/GOD/RGO/PB-CS/Au。

1.4检测方法

采用三电极系统检测：工作电极为修饰电极，参比电极为Ag/AgCl(3 mol/L KCl)，对电极为铂丝。在室温下，采用循环伏安法(CV)对电极的修饰过程进行表征，并采用电流-时间(I-t)曲线法研究传感器对葡萄糖的电流响应。

2 结果与讨论

2.1扫描电镜

首先采用扫描电镜(SEM)对PB-CS和RGO/PB-CS修饰电极进行表征。图1 a)为PB-CS的SEM图像。可以看到，PB是纳米立方体结构，平均边长为50 nm，PB-CS均匀分布在电极表面；从图1 b)可知，当RGO滴加到PB-CS修饰电极上后，能看到多层褶皱式的RGO薄膜[10]完全覆盖在PB-CS表面[11]。由此表明RGO和PB-CS已经修饰到电极表面。

图1 不同修饰电极的SEM图像Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM) images of different modified electrodes

2.2电极修饰过程表征

实验采用CV对电极表面进行表征。修饰电极在0.1 mol/L PBS溶液(含0.1 mol/L KCl，pH值为6.5)中的CV如图2所示。同裸金电极(见图2 a)相比，电沉积PB-CS(见图2 b)后，出现一对明显的氧化还原峰，这与普鲁士蓝和普鲁士白的相互转化相对应[12]。当在PB-CS/Au上修饰RGO后(见图2 c)，与PB-CS/Au(见图2 b)相比，峰电流明显增大，表明RGO大大改善了传感器的导电性和电子转移过程。当进一步修饰上GOD后(见图2 d)，峰电流显著下降，说明GOD作为一种非导电物质，阻碍了电子传递，电流响应明显减少。再修饰上CS后(见图2 e)，峰电流又有所增加，这可能是由于CS具有微弱的导电性。以上结果表明PB，RGO，GOD和CS成功组装到金电极上。

图2 不同修饰电极在0.1 mol/L PBS的循环伏安图 Fig.2 CVs of different modified electrodes in 0.1 mol/L PBS

2.3RGO对传感器电流响应的影响

实验考察了RGO对生物传感器电流响应的影响。采用2支不同的修饰电极CS/GOD/PB-CS/Au和CS/GOD/RGO/PB-CS/Au，在PBS(0.1 mol/L，pH值为6.5)和含有10 mmol/L葡萄糖的PBS溶液中进行循环伏安测定。实验结果显示，不加RGO的修饰电极在加入葡萄糖前后的电流变化值为1.96 μA，与之相比，CS/GOD/RGO/PB-CS修饰电极对葡萄糖的电流响应值为4.35 μA。结果表明，RGO的加入显著提高了传感器对葡萄糖的电化学响应，这归结于RGO独特的物理化学性质[1]和RGO与PB-CS间的协同作用。

2.4传感器对葡萄糖的电流响应

图3为CS/GOD/RGO/PB-CS修饰电极在含有不同浓度的葡萄糖溶液中的CV图。由图3可以看出，与未加葡萄糖的CV图(见图3 a)相比，在加入1.0 mmol/L葡萄糖后(见图3 b)，还原峰电流增加，并且随着葡萄糖浓度的增加(见图3 c和图3 d)，还原峰电流进一步增大，这是由于葡萄糖的加入在CS/GOD/RGO/PB-CS修饰电极表面发生的生物电催化反应所致。图3的内插图展示了还原峰电流值与葡萄糖浓度之间的关系。

本实验还考察了在0.0 V工作电位下，该生物传感器对葡萄糖的电流响应，结果如图4所示。加入葡萄糖溶液后，还原电流快速增加，在5 s内达到稳态电流的95%，表明传感器对葡萄糖响应迅速。葡萄糖浓度在0.01～1.05 mmol/L范围内，响应电流与葡萄糖浓度呈线性关系，相关系数为0.999 9，检测限为6 μmol/L，由标准曲线斜率计算得到的灵敏度为65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2，与其他文献报道的基于石墨烯的葡萄糖传感器相比[13-14]，灵敏度得到了显著改善。计算求得米氏常数为1.43 mmol/L，比天然GOD[15]以及

图3 CS/GOD/RGO/PB-CS/Au电极对葡萄糖响应的循环伏安图(内插图为还原峰电流值与葡萄糖浓度之间的关系) Fig.3 CVs of the CS/GOD/RGO/PB-CS/Au electrode for different concentrations of glucose(Inset,the changes of the reduction peak current with the increase of the glucose concentration)

图4 CS/GOD/RGO/PB-CS/Au电极对葡萄糖响应的电流-时间曲线(内插图为葡萄糖响应的标准曲线)Fig.4 Current-time curves of the CS/GOD/RGO/PB-CS/Au electrode for glucose (Inset,standard response curve of glucose)

最近报道的葡萄糖传感器的值[13-14]都要小。较小的米氏常数表明该修饰膜固定的酶与底物的亲和力比较大，显示了较高的催化活性。

2.5传感器的选择性、重现性、重复性和稳定性

本实验中采用I-t曲线法考察了该传感器的选择性。依次在底液中加入葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、对乙酰氨基酚、L-酪氨酸和L-半胱氨酸。结果显示，加入葡萄糖之后，响应电流迅速增加，而加入尿酸、抗坏血酸、对乙酰氨基酚、L-酪氨酸和L-半胱氨酸后，响应电流变化很小，可以忽略不计。结果表明该酶电极在低电位(0.0 V)对葡萄糖具有很好的选择性。这主要是由于覆盖在酶膜外层的CS在电极表面交联成致密的网状结构，可以阻止电活性干扰物质的渗入，但不妨碍H2O2的自由通过，因此提高了传感器的选择性[16]。实验中制作3支CS/GOD/RGO/PB-CS修饰电极，对0.1 mmol/L葡萄糖分别进行检测，考察了传感器的重现性，相对标准偏差为6.3%。同时也考察了该传感器的重复性，用同一支电极连续6次检测0.1 mmol/L葡萄糖，得到的相对标准偏差为4.2%。结果表明该传感器具有良好的重现性和重复性。将已修饰好的电极置于0.1 mol/L PBS中，于4 ℃储存备用，对其稳定性进行考察。结果表明，13 d后，该生物传感器对0.5 mmol/L葡萄糖的电流响应仅降低了5%，表明此传感器具有良好的稳定性。

2.6血清标本中葡萄糖检测

本实验还考察了该生物传感器在实际样品中的应用，为了验证传感器在实际样品中对葡萄糖的响应，采用标准加入法，将构建的传感器用于检测糖尿病人血糖浓度。由表1可以看出，通过本方法检测葡萄糖获得的回收率为93.9%～100.0%，表明该方法检测葡萄糖具有较高的准确性。

表1 糖尿病人血清中葡萄糖测定结果Tab.1 Results of glucose testing in serum of diabetic patients

注：*为平均值，N=3。

3 结 语

通过将GOD固定在RGO/PB-CS修饰的金电极表面，成功构建了一种高灵敏度的葡萄糖生物传感器。将RGO与PB-CS相结合，有效促进了电极表面与分析底物之间的电子转移，并且改善了该传感器的工作性能。此外，RGO和CS也有助于增加GOD在电极表面的吸附量，为GOD的固定提供一个适宜的微环境。同时该传感器用于糖尿病人血糖的快速测定，取得了满意的效果，具有潜在的应用价值。

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Study of high sensitive glucose biosensor based on reduced graphene oxide/Prussian blue-chitosan nanocomposite

ZHAO Haiyan1, WANG Beibei1, LI Xianrui1, REN Jujie2, JI Xueping1

(1. Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050017, China; 2. School of Science, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

With Prussian blue (PB)-chitosan (CS) nanocomposite directly electrodeposited on Au electrode, combined with reduced graphene oxide (RGO) and immobilized glucose oxidase (GOD), a RGO/PB-CS nanocomposite based glucose biosensor is constructed. The results show that due to the superb physicochemical property of RGO and the synergistic effect between RGO and PB-CS nanocomposite, the electrochemical response of the biosensor to glucose is obviously improved. The biosensor shows a high sensitivity of 65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2and a low detection limit of 6 μmol/L. The apparent Michaelis-Menten constant of enzymatic reaction is 1.43 mmol/L, showing high affinity of the immobilized GOD and glucose.

reduced graphene oxide; Prussian blue; chitosan; glucose oxidase; biosensor

2014-03-07；

2014-04-10；责任编辑：张士莹

河北省教育厅科学研究重点项目(ZH2012078)

赵海艳(1988-)，女，河北廊坊人，硕士研究生，主要从事电化学分析方面的研究。

籍雪平教授。E-mail:xuepingji@126.com

1008-1542(2014)03-0237-05

10.7535/hbkd.2014yx03005

O175.8

A

赵海艳，王贝贝，李献锐，等.基于还原氧化石墨烯/普鲁士蓝-壳聚糖纳米复合物的高灵敏葡萄糖生物传感器研究[J].河北科技大学学报,2014,35(3):237-241. ZHAO Haiyan, WANG Beibei, LI Xianrui, et al.High sensitive glucose biosensor based on reduced graphene oxide/Prussian blue-chitosan nanocomposite[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(3):237-241.