抗菌性室温固化PMMA材料的细胞毒性及致突变性研究

申证暄,张赐童,孙世群,王玉峰,王晓容*

(1．吉林大学口腔医学院，吉林 长春130021；2．吉林大学口腔医院 修复科，吉林 长春130021)

室温固化聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)是口腔修复临床应用的主要材料之一，具有操作简单、固化迅速、价格便宜等优点。但由于其特殊组成、表面多孔性和吸水性，易造成微生物的定殖难以清除，从而破坏口腔内微生态平衡，引起口腔疾病。纳米载银无机抗菌剂兼具纳米无机材料超微性、比表面积大特征和银离子的抗菌广谱、强效等优势而受到了学者的广泛认可[1]。本课题组已有研究表明[2]：添加2%纳米载银无机抗菌剂的室温固化PMMA材料可以有效改善原材料的抗菌性，且不会对材料的机械性能产生不良影响。本实验通过细胞毒性试验和微核试验，检测含2%纳米载银抗菌剂的室温固化PMMA材料的细胞毒性及潜在致突变性，为评价其生物安全性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1主要材料及仪器日进义齿基托聚合物Ⅱ型粉剂(仿生型)液体(日进齿科材料有限公司)；纳米载银无机抗菌剂RHA-1(上海润河纳米材料科技有限公司)；小鼠成纤维细胞(中科院上海细胞库)；酶联免疫检测仪(美国Thermo公司)；昆明小鼠(吉林大学实验动物中心)；吉姆萨染液(南京建成科技有限公司)；环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

1.2样品制备按比例将纳米载银无机抗菌剂与室温固化PMMA粉剂混合，置球磨机中研磨8 h制成抗菌母料，母料中再次加入一定室温固化PMMA粉剂，研磨24 h稀释成含2%浓度抗菌剂的室温固化PMMA。按规定粉液比，在室温20℃左右条件下，制成试件。将试件按1 g∶5 ml的比例， 37℃恒温箱中浸提24 h，制备浸提液。

1.3细胞毒性实验方法选取L929细胞，培养至细胞贴壁生长，收集细胞并计数，将细胞接种至96孔板，每组6孔，每孔细胞数为4×103个，培养24 h，弃原液，PBS漂洗2次，实验组加入100 μl 100%浸提液，空白组加入100 μl新鲜培养液，阳性对照组加入100 μl DMSO，培养48 h。向培养板中加入浓度为0.2 mg/ml的MTT继续孵育4 h，弃上清，加入200 μl DMS，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值，并计算细胞相对增值率。

1.4微核实验方法健康昆明小鼠50只，雌雄各半，随机分5组，每组10只(实验过程中各别昆明小鼠死亡，补足每组10只)。各实验组均以50 ml/kg浸提液灌胃毒染，其中高剂量组浓度为200 mg/ml，中剂量组浓度为40 mg/ml，低剂量组浓度为8 mg/ml，阴性对照组以50 ml/kg生理盐水灌胃毒染，阳性对照组以40 mg/kg环磷酰胺腹腔注射毒染。采用30 h给受试物法，末次毒染6 h后颈椎脱臼处死。取股骨骨髓制片，每只小鼠涂片1张。在空气中自然晾干后放入甲醇中固定10-15 min。用1份Giemsa 储备液：6份pH6.8磷酸盐缓冲液配成Giemsa 应用液，染色15-20 min，蒸馏水冲洗并晾干。先以低倍镜粗检，选择细胞分布均匀，染色良好的区域，再在1000倍镜下观察计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈橘红色，微核为紫红色或蓝紫色。每片计数1000个嗜多染红细胞，计算微核率。同时考虑200个细胞中嗜多染红细胞与成熟红细胞比值，若比值≥1为正常，若比值<1可能对骨髓细胞产生毒性。

1.5统计学分析

实验数据采用卡方检验，P<0.05时具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组毒性反应均为0级，阳性对照组细胞毒性为4级，见表1。

2.2 实验组与阴性对照组比较，小鼠PCE微核率无显著差异(P>0.05)，但各实验组的微核率均低于阳性对照组(P<0.05)，见表2。骨髓细胞涂片中可见微核细胞、单核细胞及双核细胞。

表1 抗菌性与非抗菌性室温固化PMMA组OD值比较(平均值±标准差)

表2 各实验组微核率比较(平均值±标准误)

△:与阳性对照组比较，P<0.05

3 讨论

生物材料应具有良好的组织相容性[3，4]、生物安全性及功能性。遗传毒性试验是生物安全性重要检测指标之一，用于评价材料的致畸、致癌、致突变能力，以了解材料对机体的远期作用。微核试验是通过观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，其结果阳性说明受试物是遗传毒物，具有潜在致突变作用。

根据国家标准YY/T0127.12-2008，实验阴性组微核细胞率应小于0.5%，本实验阴性对照结果为0.28%，符合要求。环磷酰胺是国家标准中规定的具有致突变作用的阳性指示剂之一，应用剂量为40 mg/kg时微核率范围一般为2.2%-3.0%[5]，本实验阳性对照结果为2.63%，符合要求。实验得出的结果表明本次试验操作规范及动物的灵敏度正常。并且，实验阴性对照组与阳性对照组的微核率差异有统计学意义，证明此实验结果可信。

细胞毒性试验是医疗生物学评价体系中重要的检测指标之一，几乎是各种用途的医疗器械和材料临床应用前的必选项目。噻唑蓝比色法被称之为“细胞毒性检测的标准方法”[6]，具有较高灵敏度，检测指标客观[7]且能定量分析。因此本实验采用该方法进行体外细胞毒性检测。细胞毒性结果显示，在本试验条件下，L-929 细胞在经过受试物浸提液培养2 d后，经MTT 法检测所得细胞毒性为0 级，受试物对该细胞无毒性作用。倒置显微镜下出现同样结果，各组图片中细胞均未见细胞的细胞膜破坏，细胞核异常。可以认为含2%浓度纳米载银抗菌剂的室温固化PMMA材料无细胞毒性。

参考文献：

[1]赵明哲，汲 平.纳米技术在口腔修复领域的应用前景及进展[J].口腔颌面修复学杂志，2008，9(01)：76.

[2]贾春丽，王晓容，张赐童，等.添加纳米载银无机抗菌剂的室温固化PMMA材料体外抗菌效果评价[J].吉林大学学报(医学版)，2012，38(02)：899.

[3]Sadowsky SJ. An overview of treatment considerations for esthetic restorations:A review of the literature[J].Prosthet Dent，2006，96(6)：433.

[4]Hao W，Hu YY，Wei YY，et al.Collagen I gel can facilitate homogenous bone formation of adipose-derived stem cells in PLGA-beta-TCP scaffold[J].Cells Tissues Organs，2008，187(2)：89.

[5]陆 华，孙 皎，黄哲伟，等.微核试验评价强化聚乙烯的潜在致突变性[J].口腔材料器械杂志，1999，8(02)：68.

[6]Rossberg S. Standardverfahren for die Zytotoxizitatsprufung:der MTT-Test[J].Z Zahnarrztl Implantol,1988,4:251.

[7]Mockers O,Deroze D,Camps J.Cytotoxicity of orthodont ic band s,brackets and archw ires in vitro[J].Dent Mater,2002,18(4):3.