传统中药分析中常用色谱分析及衍生化方法综述

高凡茸等

摘 要：传统中药中所包含的天然生物活性化合物成分十分复杂，国内外制药公司正在将中药作为天然活性化合物资源库，同时中药的质量稳定性和可控性也在中药现代化的进程中变得越来越重要。要开发利用这些化合物，同时建立中药的质量标识，不同色谱分析方法的应用显得越来越重要。该文综述了近几年来常用的生物活性成分色谱分析和衍生化方法，为更好地了解这些成分结构和活性提供研究基础。

关键词：中药；生物活性成分；色谱；衍生化

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）15-23-03

在中药的开发过程中，其关键问题是质量的稳定性和可控性。一般中药的识别是通过其形态学、TLC鉴别或者含量测定的几个标志物，然而这种方法由于不能提供药品的全部性质，所以不能区分具有相似形态或者相似化学组成的中药。如绿原酸不能用来区分金银花和菊花的花朵，用齐墩果酸无法识别女贞子、牛膝或威灵仙的根。中药的多靶点和协同作用的特性来自于它们具有多种成分，因此，在天然药物中找到一种用来反映大多数成分变化的综合方法是有必要的，尤其是药理作用和临床疗效的相关变化。近几年来，中药分析已经开始着重于其整体性和综合性，许多综合方法（比如指纹图谱—包括色谱法和光谱法、多组分分析）已经被用于中药质量控制，一些基于研究药物的吸收、分布、代谢和消除性能的生物色谱法也已经被用于中药分析和生物活性标志物的筛选，并且人们引入一些其他系统生物学（包括基因组学和蛋白质组学）来更清晰更科学地研究中药。本文主要综述了色谱分析及衍生化方法在中药定性及定量分析方面的研究应用。

1 薄层色谱法（TLC）

TLC对于中草药分析鉴别是一个简单、低成本、多用途的常用方法。该方法提供更多的信息和参数对中药进行全面识别和评价。与常规TLC有显著不同的微乳液薄层色谱（ME-TLC），其可以提供更高的检测灵敏度和更好的分辨率及重现性[1]。

2 GC及其联3用技术

由于GC和GC-MS的灵敏度、稳定性和高效率，该方法通常用于中药中挥发油成分的分析。全二维气相色谱（GC×GC）[2-3]是一种新颖的技术，该技术迅速对复杂混合物的分析具有明显优势，被认为是气相色谱法中最强大和最灵活的分离工具。这项技术是通过一个调制器将2根色谱柱与不同的分离机制结合在一起，因此它具有更高的灵敏度，更好的分辨率和容量，便于未知的化合物鉴定的组分离。利用该技术，在羌活中一共有769个化合物被初步鉴定和量化，对不同产地的这种植物分化提供了有用的信息。该方法常被人们用来发现一些微量化合物或者污染物，建立全面的指纹图谱和探索中药或其他药物中未知的挥发性化合物等。

3 HPLC及其联用技术

在中药众多的分析方法中，HPLC仍然是最流行的方法，这是由于它易操作、适用性广，同时对中药定性和定量准确度高。有学者研制出了一个HPLCESI/TOF-MS 方法，该方法能够同时地分析和量化山茶花中32种活性化合物，具有高选择性、高灵敏度和高精确度的特点[4]。然而，很难获得这么多对照品，所以大多数这样多组分定量方法仍被保留在实验室研究中。此外，在不同的仪器、不同的实验室相对校正因子的潜在波动应进一步验证。

HPLC的一个主要优点是可以和许多检测器联用，比如UV、DAD、ELSD、FLD、RID、MS和NMR等，HPLC可以提供更多的可能性用来探测不同的组成类型[5-11]。最近几年，人们已经将电量检测电极阵列（HPLC-CEAD）和电雾式检测器（CAD）引入中药分析[12-13]。CAD[7]是一个定量检测器，该检测器是进行三七皂苷分析时第一次将其运于中药分析，它和ELSD有着相似的性能，比如适合于UV无吸收或吸收弱的化合物，但是CAD有着更高的灵敏度，更宽的测试范围和更好的重现性。除了HPLC获得更合理的检测器，毛细管高效液相色谱和超高效液相色谱（UPLC）的出现提高了分析效能，所以取得了分析时间更短、分离效果更好的结果[14]。到目前为止，已经报道将UPLC运于中药分析的例子越来越多[15]。HPLC研究的另一个有前途的发展是引入全二维LC法（2D HPLC），该法比一维LC法更高的能力、分辨率和分离效率[16]。Ma结合排阻色谱和反相液相色谱柱去分析复杂的药方，清开灵注射液。和传统的一维色谱法相比，2D LC具有较高的峰值容量和自动化程度高[17]。

在实际应用中，人们发现有些因素影响二维色谱的发展，比如：（1）在二维色谱中非正交和小峰容量；（2）不亲和性，包括二维中流动相的不混溶性和流动相与MS检测器之间的不亲和性；（3）2个维度不匹配的分离速度，尤其是慢的速度在第二维中。因此，为了解决这些问题，人们已经做了一些改进。比如，新接口的开发是为了克服溶剂不混溶性，并减少了进样体积到第二维；一些新的固定相，比如乙二醇固定相和β-环糊精固定相，或者新的组合反相和亲水作用色谱法（RPLC/HILIC）、排阻色谱和反相色谱法（SEC/RPLC），离子交换和排阻色谱法（IEC/SEC）]被引入到2DLC系统，除了常用的NPLC和RPLC的组合[18]。

HPLC检测及其联用技术等在应用上的大力发展，为中药中活性成分的研究打下了坚实的基础，然而，许多活性成分，如氨基酸类、糖类等，因为本身不具有光学活性或活性很低，难以在常规条件下检测得到，衍生化方法则可以很好地解决这一问题。衍生化方法的作用主要是通过衍生化试剂为活性成分带上一个具有光学活性的基团，使活性成分的信号增强，提高上述样品检测的灵敏度。同时，经过衍生化之后的活性成分可能发生结构上的改变，所以衍生化方法还可以降低活性成分的分离难度，为活性成分的回收纯化奠定基础。

常用衍生化试剂一般分为紫外和荧光2类，同时一般具有荧光基团的物质都能吸收紫外光，因此，荧光衍生化试剂适用于紫外和荧光检测器同时检测。常用的衍生化方法包括柱前衍生化方法和柱后衍生化方法2类。因为柱前衍生化方法对衍生化反应的动力学因素、反应试剂、条件和时间等限制较少，而且所得衍生化产物可以在衍生化之后进一步进行纯化，而不要求附加的仪器设备，所以柱前衍生化方法的应用更为广泛。endprint

早期的衍生化试剂大多是采用还原胺化的原理，所以衍生化试剂多含有氨基结构。氨基吡啶（2-AP）是早期研究中常用的衍生化试剂，且仍在现代研究中被广泛采用。氨基吡啶衍生化反应的原理在于，通过2-AP的氨基，还原胺化后为糖类成分的还原端带上荧光基团，得到的衍生化产物可以同时被紫外检测器和荧光检测器进行检测。然而，2-AP衍生化也存在一些不足之处，如过量的衍生化试剂、衍生化反应过程中产生的一些副反应产物等，都可能干扰衍生化产物的检测，必须提前除尽。氨基苯甲酸醉类衍生化试剂如氨基苯甲酸（2-AA）是一种低特异性、高灵敏性的衍生化试剂，能与各类不同的糖类成分反应，得到具有紫外基团的衍生产物。而在一般的HPLC分离检测中，2-氨基苯甲酞胺（2-AB）越来越受到广泛的利用，这是因为2-AB进行还原胺化反应后，可以忽略检测过程中的背景信号，且适用于糖苷、寡糖和糖蛋白等多种含糖成分。

基于还原胺化反应的衍生化反应具有上述特点，但是因为反应过程需要加酸催化，而且反应过程耗时长，且进度难控制，所以被1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）逐步取代。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化反应无需酸催化作用，产生的衍生化产物不存在立体异构体的问题，而且因为产物带电，所以可以选择多种分离模式，满足不同的分析要求。当前在研究者的不断尝试和改进下，PMP衍生化不仅可以完成中性糖、酸性糖和碱性糖成分的分离，还可以用于单糖、寡糖以及氨基酸的分离检测。

此外，还有一些衍生化试剂，如2-氨基乙硫醇（2-aminoethanethiol，AET），2-氨基苯硫醇（2-aminobenzenethiol，ABT），l，2-二氨基-4，5-亚甲基二苯酚，8-氨基萘-l，3，6-三磺酸二钠盐（8-amino-naphthalene-l，3，6-trisulfonic acid，ANTS）等，则适用于电泳分离、质谱直接检测等。

4 毛细管电泳

毛细管电泳（CE）的主要缺点是灵敏度低，原因是进样体积小和在最常用的UV检测器中光程短。为了提高检测灵敏度，人们提出2个主要的方法：一个是运用更高灵敏度的检测器（比如激光诱导荧光（LIF）、电化学、MS、荧光和化学发光检测器），另一个是检测样品的预浓缩[19]。在过去5a，人们已经开发了几种在线样品预浓缩的方法。在某种情况下，在样品预浓缩之后，灵敏度提高多于100倍.

在中药运用CE分析的过程中，为了获得更好的分离结果，应该使色谱条件（包括缓冲液浓度、pH、添加剂和电压）达到最佳。一些方法（包括单因素设计、正交设计、均匀设计、中心合成设计和遗传算法）已经被人们使用。除了这些，Jiao等运用连续小波变换（CWT）解决CE中重叠峰和定量确定共洗脱化合物[20]。

5 结语

在目前的分析方法中，色谱法仍然是主流。中药的使用，在我们国家有着悠久的历史，如果通过对中药中生物活性成分色谱分析方法的研究，发现有效的生物活性成分，并将其引入戒毒领域研究，这将为我国在禁毒领域的戒毒药物的研究提供了强有力地技术保证。

参考文献

[1]Lee CJ，Huo YS，Lee LH，et al.Immunomodulating fungal and plant polysaccharides：Biochemistry，immunologic activity and clinical application[J].J Trad Med，2004，21：67-80.

[2]Wasser SP.Medicinal mushroom science：history，current status，future trends，and unsolved problems[J].Int J Med Mushr，2010，12：11-16.

[3]Chang R.Bioactive polysaccharides from traditional Chinese medicine herbs as anticancer adjuvants[J].J Altern Complement Med，2002，8：559-565.

[4]Xiao-Yan Gaoa，Yong Jianga，Jian-qiu Lub，Peng-Fei Tua.One single standard substance for the determination of multiple anthraquinone derivatives in rhubarb using high-performance liquid chromatography-diode array detection[J].Chromatogr.A，2009，1216（11）：2118-2123.

[5]Moradali MF，Mostafavi H，Ghods S，Hedjaroude GA.Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi （macrofungi） [J].Int Immunopharmacol，2007，7：701-724.

[6]Caffall KH，Mohnen D.The structure，function，and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides[J].Carbohydr Res，2009，344：1879-1900.

[7]Ermerk IM，Barabanova AO，Kukarskikh TA，et al.Natural polysaccharide carrageenan inhibits toxic effect of Gram-negative bacterial endotoxins[J].Bull Exp Biol Med，2006，141：230-232.endprint

[8]Lau KM，He ZD，Dong H，et al.Anti-oxidative，anti-inflammatory and hepato-protective effects of Ligustrum robustum[J].J Ethnopharmacol，2002，83：63-71.

[9]Paulsen BS.Biologically active polysaccharides as possible lead compounds[J].Phytochem Rev，2002，1：379-387.

[10]Paulsen BS，Barsett H.Bioactive pectic polysaccharides[J].Adv Polym Sci，2005，186：69-101.

[11]Yamada H，Kiyohara H.Immunomodulating activity of plant polysaccharide structures[J].Comprehensive Glycosci，2007，4：663-694.

[12]Moradali MF，Mostafavi H，Ghods S，Hedjaroude GA. Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi （macrofungi） [J].Int Immunopharmacol，2007，7：701-724.

[13]Kidd PH. The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment[J]. Alt Med Rev，2000，5：24-27.

[14]Zekovic DB，Kwiatkowski S，Vrvic MM，et al.Natural modified （1，3）-beta-glucans in health promotion and disease alleviation[J]. Crit Rev Biotechnol，2005，25：205-230.

[15]Xintian Zheng，Peiying Shi，Yiyu Cheng，Haibin Qu.Rapid analysis of a Chinese herbal prescription by liquid chromatography–time-of-flight tandem mass spectrometry[J].Chromatogr.A，2008，1206 （2）：140-146.

[16]Yanming Liu，Xingya Xue，Zhimou Guo，et al.Novel two-dimensional reversed-phase liquid chromatography/hydrophilic interaction chromatography，an excellent orthogonal system for practical analysis[J].Chromatogr.A，2008，1208（1-2）：133-140.

[17]Hongzhe Tian1，Jing Xu，Yafeng Guan.Comprehensive two-dimensional liquid chromatography （NPLC×RPLC） with vacuum-evaporation interface[J].Sep.Sci，2008，31（10）：1677-1685.

[18]Nair PK，Rodriguez S，Ramachandran R，et al.Immune stimulating properties of a novel polysaccharide from the medicinal plant Tinospora cordifolia[J].Int Immunopharmacol，2004，4：1645-1659.

[19]Inoue A，Kodama N，Nanba H.Effect of Maitake （Grifola frondosa） D-fraction on the control of the T lymph node Th-1/Th-2 proportion[J].Biol Pharm Bull，2002，25：536-540.

[20]Long Jiaoa，Suya Gaoa，Fang Zhangb，et al.Quantification of components in overlapping peaks from capillary electrophoresis by using continues wavelet transform method[J].Talanta，2008，75（4）：1061-1067.

（责编：张宏民）endprint