固相萃取—高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物的含量

万泽文等

摘 要：建立了水产品中喹乙醇药物残留量测定的固相萃取-高效液相色谱法。样品匀浆后经盐酸水溶液超声提取，MAX柱净化和富集后，采用紫外检测器在320 nm处对喹乙醇代谢物进行检测。实验结果表明，喹乙醇代谢物分离效果好，检出限（LOD）为4.0μg/kg，定量限（LOQ）为12.0 μg/kg，相对标准偏差为3.24%～8.03% （n=6），加标回收率达到71.5%～89.2%。该方法具有比较高的重现性和选择性，在水产品中喹乙醇代谢物的残留测定中具有很好的应用前景。

关键词：固相萃取；高效液相色谱法；喹乙醇代谢物；水产品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又称喹酰胺醇，是一种促生长作用的饲料添加剂，可促进动物生长，提高饲料转化率和利用率，被广泛用于水产养殖动物饲料添加剂。喹乙醇对鱼类致病菌均有较好的抑制作用，可用于治疗淡水养殖鱼类败血症等病症的防治。但是喹乙醇添加过量会引起中毒，且对大部分动物有致畸作用，对人类也有潜在的三致作用。因此喹乙醇在动物源性食品中的残留引起人们的重视，世界大多数国家禁止在水产品养殖和治疗中使用喹乙醇，欧盟在EC 2788/98决议中将喹乙醇列为禁用药。我国也明文规定禁止将喹乙醇用于家禽及水产养殖。

目前喹乙醇代谢物的检测方法是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，液相色谱串联质谱法提高了对目标物的准确性和灵敏度，但是由于仪器昂贵，检测成本高，不易推广。高效液相色谱法在使用上方便、快捷，灵敏度也达到要求，因此本文通过简化前处理过程，采用固相萃取方式进行净化，利用紫外检测器对喹乙醇代谢物进行了检测，缩短了前处理时间，灵敏度高，能实现对喹乙醇代谢物的快速检测，满足水产品质检以及相关基础研究的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，配备2489紫外可见光检测器；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

喹乙醇代谢物标准品（德国R-Biopharm 公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸乙酯（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美国色谱科）。

1.2 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）样品至于50 mL离心管中，向离心管中加入10 mL2mol/L盐酸溶液提取，漩涡混匀后超声提取20min，8000 r/min离心10 min，上清液倒入新的离心管中，重复操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，将备用液过柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱，收集提取液和洗脱液，40 ℃氮气下吹干，用1.0 mL流动相定容过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A甲醇，B为水（添加1.0%甲酸）；流动相比例为（A：B，40：60）流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30℃，检测波长为320 nm。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

选择合适的流动相使目标物能较好的分离，不妨碍检测器的正常工作在波长范围无吸收并且保护色谱柱，保证合适的柱压。本文比较了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）两种不同的流动相，经对比发现在流动相中加入一定量的酸使喹乙醇代谢物的目标物峰形更加尖锐，检测灵敏度也得到提高，但是酸性过高的，会影响色谱柱的寿命，本文选择在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到较好的分离效果，见图1。

2.2 提取方式的优化

目前喹乙醇代谢物的检测标准主要依据农业部1077号公告-5-2008《水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法》，该方法前处理简单，但是由于采用该法在萃取和反萃取过程中，目标物容易流失，造成回收率偏低，而且悬浮物较多容易堵塞滤膜，上机液体较浑浊，不但影响回收率而且会对色谱柱造成损害。本文采取用盐酸水解提取喹乙醇代谢物，超声振荡提取，混合阴离子柱净化，可显著的提高对目标物的回收率。

2.3 固相萃取柱的选择

固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低。针对极性较大的样品，净化主要采用阴离子交换柱来实现，阴离子交换柱适合酸性化合物的净化和富集，一般采用碱性溶液活化，酸性溶液洗脱，本实验采用甲醇和水活化，使填料对阴离子和非极性分子的吸附活性，使目标物保持正离子态吸附保留在柱上，提高填料对目标物的吸附活性，在洗脱时，加入酸性的有机溶液使填料失活解吸，从而使目标物从填料中洗脱下来。

本文比较了四种不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）对喹乙醇代谢物的净化效果，其回收率的结果见图2，本实验选择利用MAX柱（3mL/60mg），步骤简单，净化效果好。

2.4 线性范围和灵敏度

用流动相将喹乙醇代谢物储备液稀释成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列标准工作溶液，按照其所得峰面积的平均值与对应标准溶液的质量浓度作标准曲线，可得喹乙醇代谢物在质量浓度0.02～5.0mg/L范围内呈线性关系，其标准曲线回归方程为Y=23.54X+63.88，相关性系数大于0.9997，见图3。由此可知喹乙醇代谢物在0.02～5.0mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，可满足定量分析的要求。

在方法规定的取样质量条件下，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为4.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于3，表明目标物的检测下限（LOD）为4.0 μg/kg，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为12.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可为12.0 μg/kg。空白谱图及加标图见图4。2.5 回收率和精密度

在不同的水产品中（草鱼、中华鳖、对虾）分别添加2、20、40 ng/g三个水平的标准品，每个添加水平设6个平行，按1.2节所述条件进行加标回收率实验，可得到回收率为71.5%～89.2%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，结果见表1。说明能取得良好的回收效果。

3 小结

本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物含量的检测方法。通过对前处理条件以及色谱条件的优化，喹乙醇代谢物在0.02～5.0 mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，检出限LOD为4.0 μg/kg，定量限LOQ为12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代谢物各组分的平均回收率在为71.5%～89.2%%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，符合国内外有关标准和法规的要求。该方法并可为喹乙醇代谢物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对食品的安全工作提供了有力的保障。

参考文献（略）

摘 要：建立了水产品中喹乙醇药物残留量测定的固相萃取-高效液相色谱法。样品匀浆后经盐酸水溶液超声提取，MAX柱净化和富集后，采用紫外检测器在320 nm处对喹乙醇代谢物进行检测。实验结果表明，喹乙醇代谢物分离效果好，检出限（LOD）为4.0μg/kg，定量限（LOQ）为12.0 μg/kg，相对标准偏差为3.24%～8.03% （n=6），加标回收率达到71.5%～89.2%。该方法具有比较高的重现性和选择性，在水产品中喹乙醇代谢物的残留测定中具有很好的应用前景。

关键词：固相萃取；高效液相色谱法；喹乙醇代谢物；水产品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又称喹酰胺醇，是一种促生长作用的饲料添加剂，可促进动物生长，提高饲料转化率和利用率，被广泛用于水产养殖动物饲料添加剂。喹乙醇对鱼类致病菌均有较好的抑制作用，可用于治疗淡水养殖鱼类败血症等病症的防治。但是喹乙醇添加过量会引起中毒，且对大部分动物有致畸作用，对人类也有潜在的三致作用。因此喹乙醇在动物源性食品中的残留引起人们的重视，世界大多数国家禁止在水产品养殖和治疗中使用喹乙醇，欧盟在EC 2788/98决议中将喹乙醇列为禁用药。我国也明文规定禁止将喹乙醇用于家禽及水产养殖。

目前喹乙醇代谢物的检测方法是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，液相色谱串联质谱法提高了对目标物的准确性和灵敏度，但是由于仪器昂贵，检测成本高，不易推广。高效液相色谱法在使用上方便、快捷，灵敏度也达到要求，因此本文通过简化前处理过程，采用固相萃取方式进行净化，利用紫外检测器对喹乙醇代谢物进行了检测，缩短了前处理时间，灵敏度高，能实现对喹乙醇代谢物的快速检测，满足水产品质检以及相关基础研究的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，配备2489紫外可见光检测器；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

喹乙醇代谢物标准品（德国R-Biopharm 公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸乙酯（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美国色谱科）。

1.2 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）样品至于50 mL离心管中，向离心管中加入10 mL2mol/L盐酸溶液提取，漩涡混匀后超声提取20min，8000 r/min离心10 min，上清液倒入新的离心管中，重复操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，将备用液过柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱，收集提取液和洗脱液，40 ℃氮气下吹干，用1.0 mL流动相定容过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A甲醇，B为水（添加1.0%甲酸）；流动相比例为（A：B，40：60）流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30℃，检测波长为320 nm。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

选择合适的流动相使目标物能较好的分离，不妨碍检测器的正常工作在波长范围无吸收并且保护色谱柱，保证合适的柱压。本文比较了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）两种不同的流动相，经对比发现在流动相中加入一定量的酸使喹乙醇代谢物的目标物峰形更加尖锐，检测灵敏度也得到提高，但是酸性过高的，会影响色谱柱的寿命，本文选择在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到较好的分离效果，见图1。

2.2 提取方式的优化

目前喹乙醇代谢物的检测标准主要依据农业部1077号公告-5-2008《水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法》，该方法前处理简单，但是由于采用该法在萃取和反萃取过程中，目标物容易流失，造成回收率偏低，而且悬浮物较多容易堵塞滤膜，上机液体较浑浊，不但影响回收率而且会对色谱柱造成损害。本文采取用盐酸水解提取喹乙醇代谢物，超声振荡提取，混合阴离子柱净化，可显著的提高对目标物的回收率。

2.3 固相萃取柱的选择

固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低。针对极性较大的样品，净化主要采用阴离子交换柱来实现，阴离子交换柱适合酸性化合物的净化和富集，一般采用碱性溶液活化，酸性溶液洗脱，本实验采用甲醇和水活化，使填料对阴离子和非极性分子的吸附活性，使目标物保持正离子态吸附保留在柱上，提高填料对目标物的吸附活性，在洗脱时，加入酸性的有机溶液使填料失活解吸，从而使目标物从填料中洗脱下来。

本文比较了四种不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）对喹乙醇代谢物的净化效果，其回收率的结果见图2，本实验选择利用MAX柱（3mL/60mg），步骤简单，净化效果好。

2.4 线性范围和灵敏度

用流动相将喹乙醇代谢物储备液稀释成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列标准工作溶液，按照其所得峰面积的平均值与对应标准溶液的质量浓度作标准曲线，可得喹乙醇代谢物在质量浓度0.02～5.0mg/L范围内呈线性关系，其标准曲线回归方程为Y=23.54X+63.88，相关性系数大于0.9997，见图3。由此可知喹乙醇代谢物在0.02～5.0mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，可满足定量分析的要求。

在方法规定的取样质量条件下，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为4.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于3，表明目标物的检测下限（LOD）为4.0 μg/kg，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为12.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可为12.0 μg/kg。空白谱图及加标图见图4。2.5 回收率和精密度

在不同的水产品中（草鱼、中华鳖、对虾）分别添加2、20、40 ng/g三个水平的标准品，每个添加水平设6个平行，按1.2节所述条件进行加标回收率实验，可得到回收率为71.5%～89.2%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，结果见表1。说明能取得良好的回收效果。

3 小结

本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物含量的检测方法。通过对前处理条件以及色谱条件的优化，喹乙醇代谢物在0.02～5.0 mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，检出限LOD为4.0 μg/kg，定量限LOQ为12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代谢物各组分的平均回收率在为71.5%～89.2%%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，符合国内外有关标准和法规的要求。该方法并可为喹乙醇代谢物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对食品的安全工作提供了有力的保障。

参考文献（略）

摘 要：建立了水产品中喹乙醇药物残留量测定的固相萃取-高效液相色谱法。样品匀浆后经盐酸水溶液超声提取，MAX柱净化和富集后，采用紫外检测器在320 nm处对喹乙醇代谢物进行检测。实验结果表明，喹乙醇代谢物分离效果好，检出限（LOD）为4.0μg/kg，定量限（LOQ）为12.0 μg/kg，相对标准偏差为3.24%～8.03% （n=6），加标回收率达到71.5%～89.2%。该方法具有比较高的重现性和选择性，在水产品中喹乙醇代谢物的残留测定中具有很好的应用前景。

关键词：固相萃取；高效液相色谱法；喹乙醇代谢物；水产品

喹乙醇（olaquindox， OLA）又称喹酰胺醇，是一种促生长作用的饲料添加剂，可促进动物生长，提高饲料转化率和利用率，被广泛用于水产养殖动物饲料添加剂。喹乙醇对鱼类致病菌均有较好的抑制作用，可用于治疗淡水养殖鱼类败血症等病症的防治。但是喹乙醇添加过量会引起中毒，且对大部分动物有致畸作用，对人类也有潜在的三致作用。因此喹乙醇在动物源性食品中的残留引起人们的重视，世界大多数国家禁止在水产品养殖和治疗中使用喹乙醇，欧盟在EC 2788/98决议中将喹乙醇列为禁用药。我国也明文规定禁止将喹乙醇用于家禽及水产养殖。

目前喹乙醇代谢物的检测方法是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法，液相色谱串联质谱法提高了对目标物的准确性和灵敏度，但是由于仪器昂贵，检测成本高，不易推广。高效液相色谱法在使用上方便、快捷，灵敏度也达到要求，因此本文通过简化前处理过程，采用固相萃取方式进行净化，利用紫外检测器对喹乙醇代谢物进行了检测，缩短了前处理时间，灵敏度高，能实现对喹乙醇代谢物的快速检测，满足水产品质检以及相关基础研究的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，配备2489紫外可见光检测器；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）。

喹乙醇代谢物标准品（德国R-Biopharm 公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；乙酸乙酯（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；MAX固相萃取柱（3 cc/60 mg，美国色谱科）。

1.2 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）样品至于50 mL离心管中，向离心管中加入10 mL2mol/L盐酸溶液提取，漩涡混匀后超声提取20min，8000 r/min离心10 min，上清液倒入新的离心管中，重复操作一次，合并提取液。取MAX固相萃取柱（3 mL/60 mg）用5 mL甲醇、5mL水活化，将备用液过柱，再用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱，收集提取液和洗脱液，40 ℃氮气下吹干，用1.0 mL流动相定容过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A甲醇，B为水（添加1.0%甲酸）；流动相比例为（A：B，40：60）流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30℃，检测波长为320 nm。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

选择合适的流动相使目标物能较好的分离，不妨碍检测器的正常工作在波长范围无吸收并且保护色谱柱，保证合适的柱压。本文比较了甲醇-水、甲醇-水（1.0%甲酸）两种不同的流动相，经对比发现在流动相中加入一定量的酸使喹乙醇代谢物的目标物峰形更加尖锐，检测灵敏度也得到提高，但是酸性过高的，会影响色谱柱的寿命，本文选择在水中加入1.0%甲酸控制溶液pH值，得到较好的分离效果，见图1。

2.2 提取方式的优化

目前喹乙醇代谢物的检测标准主要依据农业部1077号公告-5-2008《水产品中喹乙醇代谢物残留量的测定 高效液相色谱法》，该方法前处理简单，但是由于采用该法在萃取和反萃取过程中，目标物容易流失，造成回收率偏低，而且悬浮物较多容易堵塞滤膜，上机液体较浑浊，不但影响回收率而且会对色谱柱造成损害。本文采取用盐酸水解提取喹乙醇代谢物，超声振荡提取，混合阴离子柱净化，可显著的提高对目标物的回收率。

2.3 固相萃取柱的选择

固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低。针对极性较大的样品，净化主要采用阴离子交换柱来实现，阴离子交换柱适合酸性化合物的净化和富集，一般采用碱性溶液活化，酸性溶液洗脱，本实验采用甲醇和水活化，使填料对阴离子和非极性分子的吸附活性，使目标物保持正离子态吸附保留在柱上，提高填料对目标物的吸附活性，在洗脱时，加入酸性的有机溶液使填料失活解吸，从而使目标物从填料中洗脱下来。

本文比较了四种不同的固相萃取柱（C18 500mg/3mL，HLB 60mg/3 mL，Alumina-N 60mg/ 3mL，MAX 60 mg /3 mL）对喹乙醇代谢物的净化效果，其回收率的结果见图2，本实验选择利用MAX柱（3mL/60mg），步骤简单，净化效果好。

2.4 线性范围和灵敏度

用流动相将喹乙醇代谢物储备液稀释成0.02、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L的系列标准工作溶液，按照其所得峰面积的平均值与对应标准溶液的质量浓度作标准曲线，可得喹乙醇代谢物在质量浓度0.02～5.0mg/L范围内呈线性关系，其标准曲线回归方程为Y=23.54X+63.88，相关性系数大于0.9997，见图3。由此可知喹乙醇代谢物在0.02～5.0mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，可满足定量分析的要求。

在方法规定的取样质量条件下，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为4.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于3，表明目标物的检测下限（LOD）为4.0 μg/kg，在阴性样品中添加喹乙醇代谢物标准溶液（添加水平为12.0 μg/kg）经测定信噪比（S/N）均大于10，表明其定量下限（LOQ）可为12.0 μg/kg。空白谱图及加标图见图4。2.5 回收率和精密度

在不同的水产品中（草鱼、中华鳖、对虾）分别添加2、20、40 ng/g三个水平的标准品，每个添加水平设6个平行，按1.2节所述条件进行加标回收率实验，可得到回收率为71.5%～89.2%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，结果见表1。说明能取得良好的回收效果。

3 小结

本文建立了固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇代谢物含量的检测方法。通过对前处理条件以及色谱条件的优化，喹乙醇代谢物在0.02～5.0 mg/L范围内其标准曲线的线性关系良好，检出限LOD为4.0 μg/kg，定量限LOQ为12.0 μg/kg；在不同的添加水平下，喹乙醇代谢物各组分的平均回收率在为71.5%～89.2%%，相对标准偏差为3.24%～8.03%，符合国内外有关标准和法规的要求。该方法并可为喹乙醇代谢物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对食品的安全工作提供了有力的保障。

参考文献（略）