连翘苷与牛血清白蛋白的相互作用

张玉霖，陈 莉

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

连翘苷是存在于连翘叶和果实里的一种活性物质,具有清热、解毒、散结排脓等功效，主治温热、疮疡、瘰疬、丹毒、班疹、流感，还有降血脂、抗氧化等功效[1]，是多种药物制剂的主要成分，但其作用机理少见报道。血清白蛋白是血浆中含量最为丰富的蛋白质，其结构简单,可与许多内源性或者外源性化合物相互作用，并对这些物质在生物体内的存储与转运发挥着重要作用[2]。牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)的结构高度相似，而BSA的价格更便宜，因此人们常常研究药物与BSA的结合情况，作为药物与HSA结合情况的一种参考[3～6]。研究药物与蛋白质的结合特性对药物分子设计、药物剂型设计、指导临床用药以及探索药物作用机理和了解药物动力学过程都有非常重要的指导意义。因此，我们采用荧光光谱法研究连翘苷与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，以了解它们之间的结合特性。

1 材料与方法

1.1 材料 RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)；PHS-3C型PH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；FA2004分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；连翘苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号110926,纯度≥98%)；牛血清白蛋白(BSA，中国科学院化学研究所)；Tris碱(三羟甲基氨基甲烷，上海伯奥生物科技有限公司)；其他试剂为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 方法 取连翘苷用适量甲醇溶解后，以二次蒸馏水配制成浓度约为2g/L 的溶液，称取两份BSA分别溶于302K、310K温度下pH=7.4的Tris-Hcl缓冲溶液，配制成1×10-5mol/L的BSA溶液；在1cm比色皿中加入2ml的BSA溶液(1×10-5mol/L)，每次加入连翘苷(浓度约为2g/L)2μl，分别在302K、310K温度(每次保温5min)下， 282nm为激发波长，激发和发射狭缝宽度分别为10nm、5nm，于300～500nm范围内扫描荧光光谱。

2 结 果

2.1 连翘苷对BSA荧光的猝灭作用 研究发现，在激发波长为282nm时，BSA的最大荧光发射波长为348nm，随着连翘苷浓度的不断增加，BSA在348nm处的荧光强度逐渐减弱，呈现典型的荧光猝灭现象，并且随着连翘苷浓度的增加，BSA的最大荧光发射波长逐渐减小，都表明两者之间发生了相互作用，连翘苷对BSA的荧光有猝灭作用。

通常，荧光猝灭符合Stem-Volmer方程[7,8]：F0/F=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q](其中，F0、F分别为无、有猝灭剂时BSA的荧光强度值；[Q] 为猝灭剂的浓度；Ksv为荧光猝灭常数；kq为荧光猝灭速率常数。τ0为没有猝灭剂时荧光物质分子的平均寿命，一般情况下，生物大分子的平均荧光寿命约为10-8s；)。根据Stern-Volmer方程，以F0/F-1对所加入的连翘苷溶液的浓度C作图(见图1)。求得302K,310K时的线性回归方程、相关系数及Ksv值和kq值见表1。

图1 连翘苷对BSA在302K、310K下的Stern-Volmer曲线

表1 连翘苷对BSA的Stern-Volmer曲线方程、Ksv值及kq值

温度/K 方程 Ksv(L/mol) kq[L/(mol·s)] 相关系数302 F0/F-1=0.000479+12654.1 C 12654.1 1.26541×1012 0.99859310 F0/F-1=-0.0136+12419.6 C 12419.6 1.24196×1012 0.99869

2.2 结合常数Ka和结合位点数n的计算 生物大分子与药物小分子相互作用的结合常数Ka、结合位点数n和猝灭剂浓度C之间满足方程： 1g(F0/F-1=1gKa+n1gc(其中，Ka为药物与BSA相互作用的结合常数，n为结合位点数。)以lg(F0/F-1)对lgC作图得到直线，见图2；由直线截距和斜率可求出连翘苷与BSA的结合常数Ka及结合位点数，见表2。

图2 302K,310K下连翘苷对BSA的lg(F0/F-1)～lgC曲线

表2 连翘苷对BSA的lg(F0/F-1)～lgC的线性方程、结合常数Ka和结合位点数n

温度/K 方程 lgKa Ka( L/mol) n R302 lg(F0/F-1)=3.827+0.9410 lgC 3.827 103.827 0.9410 0.9974310 lg(F0/F-1)=4.249+1.0395 lgC 4.249 104.249 1.0395 0.9968平均值 ～10000 0.9903 0.9971

3 讨 论

由扫描所得的光谱图可知，固定BSA浓度的情况下，随着连翘苷浓度的增加，BSA的荧光强度逐步减弱，表明连翘苷与BSA之间发生了相互作用。通常情况下认为，各种荧光猝灭剂对生物大分子的动态荧光猝灭速率常数的最大值约为2.0×1010L/(mol·s)[9]；本研究表明：302K、310K时连翘苷对BSA的荧光猝灭速率常数kq分别为1.26541×1012，1.24196×1012L/(mol·s)，均大于2.0×1010L/(mol·s)；且随着温度的升高，连翘苷对BSA的猝灭常数降低，均表明连翘苷对BSA荧光的猝灭属静态猝灭。且连翘苷与BSA的作用位点数n的平均值为0.9903,表明两者之间形成了一个结合位点。随着温度的升高，结合常数逐渐升高，这可能是由于温度的升高使药物小分子和蛋白分子之间的分子扩散和碰撞增强，从而导致了结合常数的增加。

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