MRI示踪技术在心梗干细胞移植治疗中的应用现状

崔辰，赵世华

根据世界卫生组织的报告，心血管病已经成为全球人口的最主要死因[1]。心肌梗死造成心肌细胞不可逆的损害，随着病程的进展，最终逐渐恶化为心力衰竭，严重危害患者的生命和生活质量[2]，亟需一种能有效的促进心肌细胞再生和逆转心室重构的治疗手段。而干细胞有着促进组织和血管再生的能力[3]，利用干细胞的移植治疗心肌梗死是一种有着极大的临床应用前景的新兴治疗手段。

但目前这种治疗手段还面临着种种困难。首先，对其改善心功能作用的机理认识不足，没有足够的证据能够证明在人体内有足够的移植细胞向心肌细胞分化[3-4]。其次，且难以解释基础实验中干细胞移植对心功能改善远远超过临床试验的原因[5-6]。另外，细胞移植后去向不明确，最终存留在心肌组织中的细胞量十分稀少[7]，需要对各种移植途径的效果进行对比评估。为了回答以上问题，解决在临床试验中的疑惑，探索理想的种子细胞和移植方式，找到一种理想的用于移植干细胞示踪的方法极为必要。传统的示踪方法主要是组织学检查，但该方法存在诸多的缺陷，如需要取材和无法连续动态观察等。在基础和临床研究中需要一种非侵入、可连续检测的细胞示踪法。

心脏MRI作为心功能检测的金标准，在生物材料、生物工程技术的支持下，特别是结合分子探针，可作为长时程监测细胞的移植和迁移情况的手段[8]，能同时提供精确的解剖定位、心功能以及心肌存活的情况。本文对现阶段通过MRI手段示踪移植干细胞的方法做一综述。

1 超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞成像

超顺磁性氧化铁 (SPIO)作为一种细胞示踪剂已得到广泛应用，因其能影响空间磁场的均一性，可在高浓度时降低T1和T2值，而对T2*值影响最大。由于加快了水平方向各个自旋失相位的速度，在T2*WI上可以显示为边界清晰的低信号(信号缺失)。超顺磁性氧化铁颗粒大小和在体内的代谢途径各不相同，依照其直径大小分为：直径为15～20 nm的单晶体氧化铁纳米颗粒(monocrystalline iron oxidenanoparticles，MION)，因直径最小，在血液中有很长的半衰期(10 h以上)，多用于MRA、淋巴结和肿瘤的成像； 直径在20～40 nm之间的超小型超顺磁性氧化铁颗粒(ultra-small superparamagnetic iron oxide，USPIO)，临床上常用于检查肿瘤的淋巴转移；直径在40～150 nm之间的超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)，因其静脉注射后聚集于肝脏、脾脏和内皮网状系统，常用作肝脏检查的对比剂；以及直径从一个微米到几个微米的，微米级超顺磁性氧化铁颗粒(micrometersized SPIO；MPIO)，该微粒目前主要应用于基础实验中标记细胞[9-11]。以上各种颗粒其组成大多是左旋糖苷包裹的带磁性的铁核心，在介导物(多聚赖氨酸或鱼精蛋白)的参与下被摄入细胞内，一旦氧化铁粒子进入细胞后，就可使被标记的细胞在MRI中显示为低信号。目前大多试验认为铁颗粒不会对人类干细胞的主要特性造成明显的影响[12]。

目前完成的动物实验均以不同途径(经心肌、经静脉、经皮心内膜或经皮冠脉内)在心梗动物模型体内植入铁颗粒标记的干细胞，随后在不同的时间点比较MRI的影像学表现(局限的低信号)和组织学上铁颗粒标记干细胞(铁染色)的情况来考察用铁颗粒作为干细胞示踪剂的可能性。

1.1 靶器官示踪成像

早在2003年Kraitchman等[13]和Hill等[14]分别于不同实验中，在猪的心梗模型中应用氧化铁粒子标记间充质干细胞，在3周内利用MRI评估，证实利用此方法可以在活体的水平下确认经导管移植干细胞的移植位点。Stuckey等[15]在观察到了经标记的间充质干细胞在MRI的低信号区的面积与心脏的射血分数呈负相关，认为可能由于受损更严重的心脏引起更多的干细胞迁移并停留，从而增加了低信号区的面积。国内也有有研究证实在猪心梗模型内利用氧化铁颗粒对间充质干细胞示踪的可行性[16-17]。

1.2 干细胞的归巢成像

由于干细胞有向受损组织归巢的能力，许多研究试图利用静脉注射的方式移植干细胞，并用MRI的手段示踪干细胞迁移的情况。Carr等[18]在大鼠模型心梗中利用MPIO标记的干细胞经静脉移植，移植后10周发现了低信号带，在活体的水平上利用MRI证实了经静脉移植的干细胞的向心梗组织处迁移并停留。在2011年Yang等[19]在小鼠骨髓中植入了MPIO标记的间充质干细胞，在2周内行连续MRI检查并观察到梗死区域逐渐出现低信号区，且信号强度逐渐降低，其面积也随时间的推移而增加，表示干细胞逐渐迁移到此区域。该实验也提供了氧化铁粒子标记法可以追踪细胞迁移的证据[19]。

然而，需要注意的是，目前关于MRI SPIO标记干细胞归巢示踪成像的结果并不一致。如Kraitchaman等[20]于2005年在急性心梗的犬模型3 d后经静脉注射SPIO和核素共同标记的间充质干细胞，但并没有在MRI中监测到被移植的干细胞。该实验中示踪的失败可能与实验条件的差异有关。

1.3 SPIO标记干细胞示踪的局限性

标记的特异性较低。MRI仅能通过由于铁颗粒引起的低信号间接判断干细胞的存在，而不能区分铁颗粒到底是在干细胞内，巨噬细胞内，还是在细胞间质。Amsalem等[21]在对干细胞移植后的心肌行组织学检查时发现在铁颗粒标记的干细胞的注射位点有大量的巨噬细胞浸润，经普鲁士蓝和ED1染色后，证实大部分含铁细胞为组织巨噬细胞。Terrovitis等[22]利用SPIO和β半乳糖苷酶共同标记的人(异种)和鼠(同种)的心脏源干细胞分别经心肌移植到大鼠体内并行MRI检查，两者均可见圆形低信号区。因为异种的心脏源干细胞会引起大鼠的排异反应，在3周内所有的人心脏源干细胞都会死亡。经免疫组化检查证实了大部分铁颗粒并不在干细胞内而在巨噬细胞中，因此SPIO示踪法不能证实细胞的存活。Winter等[23]也用实验也支持前两者的观点，他分别利用经氧化铁标记的死亡和存活细胞进行实验，证明不论被标记细胞是否存活，都会使MRI产生低信号区，而且在6周内，低信号区的位置和大小不改变，组织学检查证实在注射死细胞区域的铁粒子均在巨噬细胞中。由于炎症反应和不良的微环境，移植的细胞会大量死亡，细胞崩解后释放的铁颗粒会被巨噬细胞吞噬。Himes等[24]的研究表明，未被吞噬的氧化铁铁粒子会在12 h内消失，但Chen等[25]连续观察心梗处的游离氧化铁粒子，证实游离的氧化铁颗粒会在纤维化的组织间隙之间长达16 d以上，在MRI上可显影长达42 d，研究的差异可能与氧化铁粒子注射的量和不同的动物模型有关。而其他实验也发现移植后一段时间内，氧化铁粒子被巨噬细胞吞噬[25-27]。由于炎症反应或干细胞自行凋亡引起氧化铁粒子被巨噬细胞吞噬或在组织间隙存留，这些现象会造成对干细胞检测的假阳性而高估了其存活时间，因而巨噬细胞与干细胞的相互作用以及干细胞的凋亡是决定示踪成功的关键环节。然而个别研究发现，干细胞能长时间存活，且心梗区域没有巨噬细胞的浸润。Stuckey等[15]在大鼠心梗模型经心肌注射标记的间充质干细胞，通过MRI在移植后16周观测到低信号区，经组织学检查证实干细胞聚集区域没有巨噬细胞；Yang等[28]于2011年对移植到猪心梗模型中的干细胞进行了长达8周的观察，发现影像学表现和组织学检验吻合，且经免疫组织化学检测，证实含铁细胞的CD68染色为阴性，即铁颗粒没有被巨噬细胞吞噬。

理论上由于标记单个细胞的氧化铁颗粒的数目有限，每次细胞分裂就会使细胞中的氧化铁颗粒数量减半，当细胞中的氧化铁粒子浓度被稀释到一定程度时，会使低信号区逐渐变淡，甚至消失。在Terrovitis等[22]的实验中，随着标记细胞持续的在培养基中扩增，细胞中的铁粒子会逐渐减少，第三周时几乎所有细胞的铁染色均为阴性，他们认为其原因是细胞分裂产生的稀释效应。Chen等[25]在实验中观察到，随着时间的变化，低信号区域由扩散变得集中，并认为有些内源性细胞清除并聚集了铁粒子。

1.4 SPIO标记干细胞示踪法的改良

不断地探索新的标记方法、改进氧化铁颗粒的性质、运用新的序列可以改进成像的效果。通过多种成像方式的结合可以在精确定位细胞的同时显示细胞的存活情况，Zhang等[27]在通过SPIO的标记定位干细胞注射位点利用生物发光成像提供细胞的存活信息，成功的在2个月内连续观察胚胎干细胞在大鼠体内的变化。Qiao等[26]也利用PET报告基因成像与SPIO标记相结合试图探测细胞的存活和细胞与巨噬细胞的关系。另有研究者在活体内标记干细胞，避免了体外标记时造成污染的可能，且获得了更高的标记效率[29]。更多新序列的研发也提高了成像的敏感性，Mani等[30]利用新的GRASP序列使SPIO显示为高信号，使得移植位点更易被辨识。另外，通过改进SPIO表面的结构可以提高标记效率，让更多的氧化铁粒子进入细胞中[31]。

2 MR报告基因成像

考虑到SPIO直接标记法的局限性，人们试图用其他方式对干细胞进行示踪，而最有研究价值的是报告基因成像技术。由于只有存活的细胞才能不断地表达报告基因，合成出使其能在影像设备上显影的蛋白，因此报告基因成像技术可以验证细胞的存活。在目前，报告基因成像技术常用的成像手段有：生物发光成像、核素成像和MRI。利用报告基因产生MRI对比信号的方式多种多样，而原理各不相同，简言之就是给细胞导入一个可以编码可探测到的蛋白探针的基因(报告基因)，通过该基因的持续或经调控的表达而成像。

2.1 组成性基因的超表达

利用基因工程引入启动子可以使某种组成性基因超量表达产生影响T1和T2弛豫时间的蛋白质。铁蛋白作为一种普遍存在于细胞中的储铁蛋白质得到了广泛应用。由于编码铁蛋白的基因的过量表达，含铁的蛋白质会随着细胞的存活不断生成，明显增加细胞内的铁含量。过量的铁影响局部磁场的均一而在MRI上显示出示踪的目标。Naumova等[32]在2010年最早将此技术运用于心梗后移植的干细胞示踪，通过使鼠成骨骼肌细胞铁蛋白基因超量表达，使MR T2*WI中的细胞移植区产生低信号区。此区域与对照组相比减少了25%的弛豫时间。经组织学验证，成像中的移植物面积与组织学中的移植细胞散布面积高度相关(r=0.8)。在2012年该团队继续用多种不同检查序列探索最优的成像方式，同时进一步验证了之前的定量关系，与组织学对应的相关系数在T2 iMSDE 和 T2 GRE序列上分别为0.79和0.89[33]。Campan等在4周内利用相似的原理对猪心球样细胞进行示踪，并在体外实验中证实其引入的基因不会改变细胞的分化和分裂能力。

2.2 特异性SPIO示踪

Chung等[34]的研究应用另一种原理实现了MRI报告基因成像，利用基因工程手段使报告基因的表达产物分布于细胞表面形成抗原，同时将相应的单克隆抗体与SPIO结合作为分子探针。与移植细胞相结合的分子探针通过SPIO的作用成像。2011年，他们通过慢病毒载体将报告基因导入胚胎干细胞，将其注射在心梗后小鼠模型的心肌内，分别于3 d到2周内连续行MRI检查，自第5天起心脏短轴图像上显示出低信号移植位点，证实了移植细胞的存活。此方法解决了传统SPIO标记法特异性低的弊端，然而其局限性在于每次检查后与抗原结合的抗体会影响下次成像的结果；而且由于外源性的抗原导入，势必会引起免疫反应。

MRI报告基因成像虽然前景可观，但其安全性和可靠性还有待进一步的研究证实。

3 小结

利用超顺磁性氧化铁粒子可以在活体水平精确定位干细胞的移植位点，但是由于低信号影只与氧化铁颗粒的存在有关而与细胞的存在和种类无关，这种示踪方法不能提供细胞存活、增殖、分化的直接证据。如果排除巨噬细胞的干扰，延长干细胞存活的时间，则可以实现在一定时间内利用SPIO的直接标记对干细胞示踪，但目前各种实验方法选用的铁颗粒大小、标记方式、干细胞的种类、移植的方式、移植的时间点、MRI设备的场强和观察的时间点均不一致，因此结果也大相径庭，就炎症细胞对SPIO示踪能力的干扰程度还没有达到统一认识。而MRI报告基因成像在一定程度上避免了传统SPIO直接标记细胞示踪的劣势，因其成像的原理保证了图像信号与蛋白质表达(细胞存活)的一致性，但其工序复杂，安全性也未得到证实。我们在了解MRI方法示踪移植干细胞的优势时，也应充分的认识到其局限性，综合利用以达到更好的示踪效果。同时我们也期待着技术的进步，克服目前所面临的种种限制，为实现“基础研究到临床应用的转化”扫清障碍。

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