RP-HPLC法测定贝那普利氢氯噻嗪片的含量

苏 敏，章志强，邓玉清，郝 程(.陕西方舟制药有限公司，西安 70075；.陕西省体育科学研究所，西安 70065；.西安天一秦昆制药有限责任公司，西安 70077)

贝那普利氢氯噻嗪片是一种治疗高血压的化学药物复方制剂，适用于用贝那普利和氢氯噻嗪单一治疗不能达到满意疗效的病人[1-2]。关于其含量测定方法，国外文献报道有薄层色谱法和高效液相色谱法[3-4]，国内到目前为止还没有高效液相色谱法的相关报道。为了更好地控制其质量，本文对盐酸贝那普利和氢氯噻嗪的HPLC含量测定方法进行了提升，对其线性、重复性、稳定性等进行了可行性研究。

1 仪器与材料

1.1仪器 高效液相色谱仪(戴安U3000)。

1.2试药 四氢呋喃(色谱纯)；冰醋酸(分析纯)；四丁基溴化铵(分析纯)；盐酸贝那普利对照品(按C24H28N2O5·HCl计，供HPLC法测定，含量为99.5%)；氢氯噻嗪对照品(按C7H8ClN3O4S2计，含量为99.8%)；贝那普利氢氯噻嗪片样品(自制)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Ultimate AQ-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：四氢呋喃-水-冰醋酸(250 mL+750 mL+4 mL，加入四丁基溴化铵1.0 g)；检测波长：240 nm；流速：1.5 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.2系统适用性实验 取有关物质CGS 14831对照品20 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液Ⅰ；取有关物质SU5683对照品适量，精密称定，加溶剂制成0.25 mg·mL-1的溶液，作为杂质对照品储备液Ⅱ；另取氢氯噻嗪对照品约6 mg和盐酸贝那普利对照品约5 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，精密加入杂质对照品储备液Ⅰ、Ⅱ分别为1 mL和1 mL，加溶剂稀释至刻度，作为系统适用性溶液[5]。

2.3方法学验证

2.3.1线性实验 取盐酸贝那普利对照品20 mg和氢氯噻嗪对照品25 mg，精密称定，置于50mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取1，2.5，4，5，7.5和10 mL储备液，置于10 mL量瓶中，用溶剂(乙腈-水-冰醋酸(100∶150∶1)稀释至刻度，摇匀，作为供试液。分别精密量取上述溶液各20 μL注入高效液相色谱仪。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标作图，进行线性回归[6]。盐酸贝那普利质量浓度在41.2～412.3 μg·mL-1范围内呈线性，回归方程为y=14 731x-88 403，r=0.999 5，氢氯噻嗪质量浓度在51.0～509.6 μg·mL-1范围内呈线性，回归方程为y=5 816.6x+9 053.9，r=0.999 8。

2.3.2精密度实验 取盐酸贝那普利对照品20 mg和氢氯噻嗪对照品25 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取20 μL上述溶液，注入高效液相色谱仪，在相同条件下，由同一分析人员对同一瓶样品重复进样6次，以峰面积的偏差为目标，考察进样精密度，记录色谱图。同一溶液连续进样6次，两主药氢氯噻嗪和盐酸贝那普利的峰面积的RSD均1.01%，0.71%和0.76%，0.69%，均小于2%，表明进样精密度良好。

2.3.3稳定性实验 将对照品和样品均配制成质量浓度约为盐酸贝那普利0.2 mg·mL-1、氢氯噻嗪0.25 mg·mL-1的溶液作为供试品溶液，分别于第0，2，4，6，8和12 h进样测定[7]。结果对照品溶液、供试品溶液中两成分峰面积在12 h内RSD值氢氯噻嗪和盐酸贝那普利分别为1.04%，0.66%，1.01%和0.84%，均小于2%，表明对照品溶液与供试品溶液均在12 h内稳定。

2.3.4重复性实验 取盐酸贝那普利对照品20 mg和氢氯噻嗪对照品25 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。取本品20片，精密称定，研细，分别取6份等量的样品，精密称取(约相当于盐酸贝那普利10 mg)，置于50 mL量瓶中，加溶剂40 mL，超声处理10 min，振摇15 min，放冷至室温，用溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜过滤，弃去初滤液6 mL，取续滤液，即得。平行操作配制6份，精密量取20 μL上述溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以外标法按峰面积计算含量。两主成分氢氯噻嗪和贝那普利含量的RSD分别为1.00%和0.90%，均小于2%，表明进样重复性良好。

2.3.5准确度实验 取氢氯噻嗪对照品25 mg和盐酸贝那普利对照品20 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。以此为基础分别配制80%～120%的对照品溶液，计算80%～120%范围内回收率，考察该方法测定的结果与真实值接近的程度。实验结果显示，盐酸贝那普利平均回收率在99.6%～101.6%之间，RSD小于2%，氢氯噻嗪平均回收率在99.3%～100.7%之间，RSD小于2%，符合平均回收率在98.0%～102.0%的要求，证明此方法准确度良好。

2.3.6回收率实验 对照品溶液：分别取氢氯噻嗪和盐酸贝那普利对照品约25和20 mg，置于100 mL量瓶中，加5 mL甲醇使溶解，并用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度；再精密量取5 mL，置于200 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。50%供试品溶液：取氢氯噻嗪和盐酸贝那普利对照品约12.5和10 mg，精密称定，置于同一含有约0.217 5 g空白辅料的100 mL量瓶中，加少量溶剂使其溶解，并用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤；精密量取续滤液5 mL，置于200 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得，共制备3份。同理，再分别配制80%供试品溶液和100%供试品溶液[8]，精密量取对照品溶液和供试品溶液各50 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1和表2及图1。

表1 盐酸贝那普利回收率实验结果

表2 氢氯噻嗪回收率实验结果

图1 HPLC图

实验结果表明，3个不同质量浓度的供试品溶液中，氢氯噻嗪和盐酸贝那普利的回收率RSD分别为0.35%和0.51%，均小于2%，回收率良好。

2.3.7样品测定 取本品20片，精密称定，研细，分别取6份等量的样品，精密称取(约相当于盐酸贝那普利10 mg)，置于50 mL量瓶中，加溶剂40 mL，超声处理10 min，振摇15 min，放冷至室温，用溶剂稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜过滤，弃去初滤液6 mL，取续滤液，即得。分别取2份等量的对照品，氢氯噻嗪25 mg和盐酸贝那普利20 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。实验结果表明，本品3 批含氢氯噻嗪分别为98.8%，99.6%和98.9%，均在标示量的95.0%～105.0%范围内，盐酸贝那普利含量分别为99.7%，100.5%和100.3%，均在标示量的92.0%～105.0%范围内，符合规定。

3 讨论

3.1色谱条件的选择 本品氢氯噻嗪、盐酸贝那普利的最大吸收波长分别为238，242和317 nm，故确定含量的检测波长为240 nm。四氢呋喃-水-冰醋酸(250 mL+750 mL+4 mL，加入四丁基溴化铵1.0 g)时主峰理论板数不低于2 000，与杂质峰分离度不小于1.5，未检出不纯物，故确定为该品种的流动相。色谱柱为Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)时主峰理论板数不低于2 000，与杂质峰的分离度不小于1.5，故确定为该品种的色谱柱。

3.2四氢呋喃用量 在本品检测中四氢呋喃用量相对较大，可适当调节流动相中的四氢呋喃量，使CGS 14831， SU 5683与氢氯噻嗪的分离度符合要求。所用四氢呋喃应保证其纯度，应临用开瓶，否则会引起色谱峰的增加。

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