番茄离体再生系统的建立及褐化现象调控研究

王蕾　宿烽

摘要：本试验的目的是建立一套完整的番茄体外组培繁殖体系，并对组培过程中容易出现的褐化现象进行控制性研究。结果表明：诱导愈伤组织的最适外植体为子叶，其最适植物生长调节剂浓度为0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA。苗龄为6 d的子叶出愈情况最好。诱导不定芽的最适植物生长调节剂浓度为0.3 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA。在培养基中添加200、600 mg/L的活性炭或10 mg/L的VC，愈伤组织和不定芽形成过程中的褐化现象可得到有效控制。最适生根方法为两步生根法，其最佳的NAA浸泡浓度为50 mg/L。最适条件下，50 d左右便可得到完整的再生植株。

关键词：番茄；组织培养；褐化

中图分类号：S641.203.6 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）03-0009-04

AbstractA complete set of in vitro propagation system of tomato was established and the browning phenomenon in this process was studied. The results showed that the optimum explant for callus inducing was cotyledon， and the optimum plant growth regulator was 0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA. The 6-day cotyledon had the best callus induction effect. The optimum plant growth regulator concentration for budding was 0.3 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA. Adding 200， 600 mg/L activated carbon or 10 mg/L VC into medium， the browning phenomenon could be controlled effectively in the formation of calluses and adventitious buds. The optimum rooting method was indirect rooting method， and its optimum NAA concentration was 50 mg/L. Under these optimum conditions， a whole regenerated plantlet could be obtained in about 50 days.

Key wordsTomato； Tissue culture； Browning

番茄是典型的双子叶植物，是植物学领域研究最多的模式植物之一。不同基因型番茄在相同的培养基上，可以发生不同的脱分化和再分化现象[1]，说明基因型是影响番茄组织培养的重要因素之一。不同的番茄外植体，如根、子叶、茎尖分生组织等，进行离体繁殖培养时，其植物生长调节剂的种类和配比也存在差异[1～3]。因此，每一个番茄品种的再生系统都是一个独立的体系，需要具体试验获得。

褐化现象严重影响外植体的脱分化和再分化过程。因此，抑制褐化的发生可以大大提高外植体的成活率，有利于番茄再生体系的建立。褐化现象主要发生在外植体、愈伤组织继代、悬浮细胞培养等过程中。褐变的机理是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响而死亡或自然死亡时，材料伤口分泌的酚类物质在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的[4]。番茄是含酚类物质较多的蔬菜，在组织培养过程中很容易发生褐变，从而引起代谢紊乱，停止分化，最终死亡。目前，许多研究人员对番茄褐化现象的控制做了研究[4，5]，但由于培养条件、基因型等多方面因素的影响，试验重复性较差。

本试验以樱桃番茄“粉丽莎”为材料，探讨番茄体外组培的最适条件，建立了一套完整的番茄离体再生系统。并对培养过程中的褐化现象进行遏制性研究，以期为今后其他番茄品种的离体组织培养提供理论指导和技术参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

以樱桃番茄品种“粉丽莎”为材料，进行体外组织培养和褐化现象遏制条件的研究。

所用培养基为MS培养基或1/2MS培养基；植物生长调节剂为吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、6-苄基氨基嘌呤（6-enzyladenind，6-BA）、2-（1-萘基）乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）。

1.2试验方法

1.2.1无菌苗培养选取籽粒饱满的番茄种子，清水浸泡5 h左右。待种子完全吸涨后，进行消毒处理：75%酒精浸泡30～60 s，10% NaClO消毒3 min，无菌水冲洗后转入1/2MS固体培养基（培养基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂[6]，pH值5.8～6.2）。组培室内暗培养1～2 d，然后在25℃、1 000 lx光照培养箱中每天光照8 h培养。

1.2.2外植体的获得种子萌发需3～5 d，分别在苗龄为2、4、6、8、10 d时切取外植体。外植体选用子叶和下胚轴，子叶切成0.5 cm×0.5 cm小片、叶背向下，下胚轴切成1 cm左右的小段[7，8]，接种到培养基中进行愈伤组织诱导。

1.2.3愈伤组织和芽诱导采用MS培养基。IAA浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mg/L，6-BA浓度分别为2、3、4 mg/L，进行单因素试验，筛选最佳的愈伤组织和芽诱导条件。

1.2.4褐化现象的遏制在筛选出的最佳培养基中，分别添加不同浓度的活性炭和VC，观察对愈伤组织和芽诱导过程中褐化的遏制情况，从而筛选出最佳的活性炭和VC添加量。活性炭浓度分别为0、200、400、600、800、1 000 mg/L，VC浓度分别为0、5、10、20、50 mg/L。

1.2.5生根诱导采用1/2MS培养基。利用一步生根法和两步生根法，分别诱导生根。一步生根法即将长势粗壮的不定芽，转入含有不同浓度NAA的培养基中进行培养，NAA浓度分别为0、0.5、1、2 mg/L。两步生根法即先将不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再转入不含植物生长调节剂的培养基中进行培养，NAA浸泡液浓度分别为10、20、50、70 mg/L。

分别统计愈伤组织、芽和根的诱导率。

愈伤组织诱导率（%）=（发生愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100

不定芽诱导率（%）=（分化出不定芽的外植体数/接种外植体数）×100[9]

根诱导率（%）=（发生根的外植体数/接种外植体数）×100

1.2.6离体再生体系的建立

在植物生长调节剂的作用下，外植体经暗培养，诱导愈伤组织；然后经光照培养，诱导芽；最后对分离的不定芽诱导生根。每阶段以10 d为周期，进行继代培养。当生根成功，整个体外再生系统的建立即完成。

2结果与分析

2.1生长调节剂对愈伤组织诱导率的影响

植物生长调节剂的浓度及配比是诱导愈伤组织形成的重要条件。以苗龄为6 d的番茄无菌苗为材料，获取子叶和下胚轴进行研究。不同植物生长调节剂浓度及配比诱导番茄愈伤组织情况如表1。

由表1可知，同等浓度的植物生长调节剂对子叶的愈伤组织诱导率高于下胚轴，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体，其最佳植物生长调节剂浓度为0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此时，愈伤组织诱导率最高，为100%。

2.2苗龄对愈伤组织诱导率的影响

由2.1结果可知，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体。在最佳植物生长调节剂浓度下，对不同苗龄的子叶进行愈伤组织诱导，研究苗龄与愈伤组织诱导率之间的关系（表2）。

由表2可知，以子叶为外植体诱导愈伤组织的最佳苗龄为6 d，此时愈伤组织的诱导率高，组织形态好，表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，器官发生潜力大，易于生芽。

3结论与讨论

本试验成功建立了“粉丽莎”樱桃番茄的体外繁殖体系，不仅具有降低栽种成本的现实经济意义，对今后其他品种体外繁殖系统的建立也提供了有力的技术支持。同时完善的体外再生系统，为番茄的转基因研究提供了良好的受体系统，保障了番茄基因转化的高效性，在番茄新品种培育、基因功能性研究等方面将发挥巨大作用。

在培养基中加入吸附剂或抗氧化剂可有效遏制褐变的产生，活性炭可以吸附外植体释放的酚类物质，使其不受毒害；VC能够阻止多酚氧化酶对酚类物质的氧化，两者均能减少褐变的发生。但试验结果表明，并不是活性炭或VC的浓度越高效果就越好。其原因在于一定浓度的活性炭，可以吸附外植体产生的酚类物质以及由此氧化产生的致死性醌类物质，且对琼脂中的杂质也有一定的吸附作用，但当活性炭浓度过高时，不仅吸收了有害物质，也吸收了培养基中的营养，因而对外植体的生长产生了抑制作用。同样，一定浓度的VC能够控制褐化现象的发生，但高浓度的VC会对培养物产生一定的干扰和毒害作用[4]。通过比较，低浓度的VC比活性炭具有更强的抑制褐化发生的能力。

本研究结果显示，两步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能够使根原基充分地吸收生长素，而根原基形成后幼根的生长并不需要高浓度的生长素，高浓度的生长素反而会抑制其生长，两步生根法正好符合了以上要求，因此更适合根的诱导。其具体机理还有待进一步的研究证实。

参考文献：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁频， 等. 番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的遗传转化[J]. 北方园艺， 2006（1）：98-100.

[2]何秀霞， 陆一鸣， 白杰英， 等. 番茄组织培养体系的建立及其影响因素的研究[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版， 2003， 18（1）： 30-33.

[3]毕建水， 李翠翠， 徐丽丽. 培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响[J].安徽农学通报， 2008， 14（13）： 41-42.

[4]潘娟， 李先源， 李名杨. 植物组织培养过程中常见问题及解决方法[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（6）： 2392-2394.

[5]陈强， 刘烨，毕晓华. 番茄愈伤组织诱导和VC控制外植体褐变[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 张兴国. 黄瓜组织研究培养[J]. 西南农业大学学报， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐跃进.黄瓜子叶外植体组培成株研究[J]. 北方园艺， 2008（6）：187-189.

[8]Ozyigit I I， Kahraman M V， Ercan O. Relation between explants age， total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton（Gossypium hirsutum L.） [J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（1）： 3-8.

[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.

1.2.5生根诱导采用1/2MS培养基。利用一步生根法和两步生根法，分别诱导生根。一步生根法即将长势粗壮的不定芽，转入含有不同浓度NAA的培养基中进行培养，NAA浓度分别为0、0.5、1、2 mg/L。两步生根法即先将不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再转入不含植物生长调节剂的培养基中进行培养，NAA浸泡液浓度分别为10、20、50、70 mg/L。

分别统计愈伤组织、芽和根的诱导率。

愈伤组织诱导率（%）=（发生愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100

不定芽诱导率（%）=（分化出不定芽的外植体数/接种外植体数）×100[9]

根诱导率（%）=（发生根的外植体数/接种外植体数）×100

1.2.6离体再生体系的建立

在植物生长调节剂的作用下，外植体经暗培养，诱导愈伤组织；然后经光照培养，诱导芽；最后对分离的不定芽诱导生根。每阶段以10 d为周期，进行继代培养。当生根成功，整个体外再生系统的建立即完成。

2结果与分析

2.1生长调节剂对愈伤组织诱导率的影响

植物生长调节剂的浓度及配比是诱导愈伤组织形成的重要条件。以苗龄为6 d的番茄无菌苗为材料，获取子叶和下胚轴进行研究。不同植物生长调节剂浓度及配比诱导番茄愈伤组织情况如表1。

由表1可知，同等浓度的植物生长调节剂对子叶的愈伤组织诱导率高于下胚轴，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体，其最佳植物生长调节剂浓度为0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此时，愈伤组织诱导率最高，为100%。

2.2苗龄对愈伤组织诱导率的影响

由2.1结果可知，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体。在最佳植物生长调节剂浓度下，对不同苗龄的子叶进行愈伤组织诱导，研究苗龄与愈伤组织诱导率之间的关系（表2）。

由表2可知，以子叶为外植体诱导愈伤组织的最佳苗龄为6 d，此时愈伤组织的诱导率高，组织形态好，表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，器官发生潜力大，易于生芽。

3结论与讨论

本试验成功建立了“粉丽莎”樱桃番茄的体外繁殖体系，不仅具有降低栽种成本的现实经济意义，对今后其他品种体外繁殖系统的建立也提供了有力的技术支持。同时完善的体外再生系统，为番茄的转基因研究提供了良好的受体系统，保障了番茄基因转化的高效性，在番茄新品种培育、基因功能性研究等方面将发挥巨大作用。

在培养基中加入吸附剂或抗氧化剂可有效遏制褐变的产生，活性炭可以吸附外植体释放的酚类物质，使其不受毒害；VC能够阻止多酚氧化酶对酚类物质的氧化，两者均能减少褐变的发生。但试验结果表明，并不是活性炭或VC的浓度越高效果就越好。其原因在于一定浓度的活性炭，可以吸附外植体产生的酚类物质以及由此氧化产生的致死性醌类物质，且对琼脂中的杂质也有一定的吸附作用，但当活性炭浓度过高时，不仅吸收了有害物质，也吸收了培养基中的营养，因而对外植体的生长产生了抑制作用。同样，一定浓度的VC能够控制褐化现象的发生，但高浓度的VC会对培养物产生一定的干扰和毒害作用[4]。通过比较，低浓度的VC比活性炭具有更强的抑制褐化发生的能力。

本研究结果显示，两步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能够使根原基充分地吸收生长素，而根原基形成后幼根的生长并不需要高浓度的生长素，高浓度的生长素反而会抑制其生长，两步生根法正好符合了以上要求，因此更适合根的诱导。其具体机理还有待进一步的研究证实。

参考文献：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁频， 等. 番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的遗传转化[J]. 北方园艺， 2006（1）：98-100.

[2]何秀霞， 陆一鸣， 白杰英， 等. 番茄组织培养体系的建立及其影响因素的研究[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版， 2003， 18（1）： 30-33.

[3]毕建水， 李翠翠， 徐丽丽. 培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响[J].安徽农学通报， 2008， 14（13）： 41-42.

[4]潘娟， 李先源， 李名杨. 植物组织培养过程中常见问题及解决方法[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（6）： 2392-2394.

[5]陈强， 刘烨，毕晓华. 番茄愈伤组织诱导和VC控制外植体褐变[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 张兴国. 黄瓜组织研究培养[J]. 西南农业大学学报， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐跃进.黄瓜子叶外植体组培成株研究[J]. 北方园艺， 2008（6）：187-189.

[8]Ozyigit I I， Kahraman M V， Ercan O. Relation between explants age， total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton（Gossypium hirsutum L.） [J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（1）： 3-8.

[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.

1.2.5生根诱导采用1/2MS培养基。利用一步生根法和两步生根法，分别诱导生根。一步生根法即将长势粗壮的不定芽，转入含有不同浓度NAA的培养基中进行培养，NAA浓度分别为0、0.5、1、2 mg/L。两步生根法即先将不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再转入不含植物生长调节剂的培养基中进行培养，NAA浸泡液浓度分别为10、20、50、70 mg/L。

分别统计愈伤组织、芽和根的诱导率。

愈伤组织诱导率（%）=（发生愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100

不定芽诱导率（%）=（分化出不定芽的外植体数/接种外植体数）×100[9]

根诱导率（%）=（发生根的外植体数/接种外植体数）×100

1.2.6离体再生体系的建立

在植物生长调节剂的作用下，外植体经暗培养，诱导愈伤组织；然后经光照培养，诱导芽；最后对分离的不定芽诱导生根。每阶段以10 d为周期，进行继代培养。当生根成功，整个体外再生系统的建立即完成。

2结果与分析

2.1生长调节剂对愈伤组织诱导率的影响

植物生长调节剂的浓度及配比是诱导愈伤组织形成的重要条件。以苗龄为6 d的番茄无菌苗为材料，获取子叶和下胚轴进行研究。不同植物生长调节剂浓度及配比诱导番茄愈伤组织情况如表1。

由表1可知，同等浓度的植物生长调节剂对子叶的愈伤组织诱导率高于下胚轴，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体，其最佳植物生长调节剂浓度为0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此时，愈伤组织诱导率最高，为100%。

2.2苗龄对愈伤组织诱导率的影响

由2.1结果可知，子叶为番茄体外组织培养的最佳外植体。在最佳植物生长调节剂浓度下，对不同苗龄的子叶进行愈伤组织诱导，研究苗龄与愈伤组织诱导率之间的关系（表2）。

由表2可知，以子叶为外植体诱导愈伤组织的最佳苗龄为6 d，此时愈伤组织的诱导率高，组织形态好，表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，器官发生潜力大，易于生芽。

3结论与讨论

本试验成功建立了“粉丽莎”樱桃番茄的体外繁殖体系，不仅具有降低栽种成本的现实经济意义，对今后其他品种体外繁殖系统的建立也提供了有力的技术支持。同时完善的体外再生系统，为番茄的转基因研究提供了良好的受体系统，保障了番茄基因转化的高效性，在番茄新品种培育、基因功能性研究等方面将发挥巨大作用。

在培养基中加入吸附剂或抗氧化剂可有效遏制褐变的产生，活性炭可以吸附外植体释放的酚类物质，使其不受毒害；VC能够阻止多酚氧化酶对酚类物质的氧化，两者均能减少褐变的发生。但试验结果表明，并不是活性炭或VC的浓度越高效果就越好。其原因在于一定浓度的活性炭，可以吸附外植体产生的酚类物质以及由此氧化产生的致死性醌类物质，且对琼脂中的杂质也有一定的吸附作用，但当活性炭浓度过高时，不仅吸收了有害物质，也吸收了培养基中的营养，因而对外植体的生长产生了抑制作用。同样，一定浓度的VC能够控制褐化现象的发生，但高浓度的VC会对培养物产生一定的干扰和毒害作用[4]。通过比较，低浓度的VC比活性炭具有更强的抑制褐化发生的能力。

本研究结果显示，两步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能够使根原基充分地吸收生长素，而根原基形成后幼根的生长并不需要高浓度的生长素，高浓度的生长素反而会抑制其生长，两步生根法正好符合了以上要求，因此更适合根的诱导。其具体机理还有待进一步的研究证实。

参考文献：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁频， 等. 番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的遗传转化[J]. 北方园艺， 2006（1）：98-100.

[2]何秀霞， 陆一鸣， 白杰英， 等. 番茄组织培养体系的建立及其影响因素的研究[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版， 2003， 18（1）： 30-33.

[3]毕建水， 李翠翠， 徐丽丽. 培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响[J].安徽农学通报， 2008， 14（13）： 41-42.

[4]潘娟， 李先源， 李名杨. 植物组织培养过程中常见问题及解决方法[J]. 安徽农业科学， 2009， 37（6）： 2392-2394.

[5]陈强， 刘烨，毕晓华. 番茄愈伤组织诱导和VC控制外植体褐变[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 张兴国. 黄瓜组织研究培养[J]. 西南农业大学学报， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐跃进.黄瓜子叶外植体组培成株研究[J]. 北方园艺， 2008（6）：187-189.

[8]Ozyigit I I， Kahraman M V， Ercan O. Relation between explants age， total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton（Gossypium hirsutum L.） [J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（1）： 3-8.

[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.