肾细胞癌中基质金属蛋白酶-12 mRNA的表达及临床意义

蒲 波,陈 颖 (解放军第222医院,吉林 吉林 132011)

肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是最常见的恶性肿瘤之一，起源于肾实质泌尿小管上皮系统，约占所有肾脏恶性肿瘤的90%[1]。世界肿瘤统计显示，肾细胞癌的发病率呈逐年上升趋势，每年全球有约20万例新发肾细胞癌，并且有超过10万例肾细胞癌病例死亡[2]。基质金属蛋白酶(matrix metallopmteinases, MMPs)是一类高度保守的生物活性依赖于锌离子、有降解细胞外基质能力的蛋白水解酶家族，目前已发现28个家族成员[3]。MMPs由5个功能不同的结构域组成：疏水信号肽序列、前肽区、催化活性区、富含脯氨酸的铰链区和羧基末端区[4]。由于MMPs能降解细胞外基质几乎所有的成分，传统观点认为MMPs在肿瘤中的侵袭和转移过程发挥了重要作用。在肾细胞癌中，有研究显示MMP2、MMP-7和MMP-9在肾细胞癌中的表达水平较正常组织升高，并且与肿瘤的侵袭和转移相关[5]。而MMP-12作为基质裂解素亚家族的一员，最初是在人肺泡巨噬细胞中被发现，无活性形式的MMP-12是分子量为5.4×104大小的蛋白，在去氮端和碳端后变为分子量2.2×104的活性形式[6]。MMP-12的活性使其可以降解Ⅳ型胶原、纤维蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖类、硫酸软骨素和髓磷脂碱性蛋白。这种活性使得MMP-12在细胞外基质降解、组织重构以及相应的肿瘤侵袭和转移中可发挥重要作用[6]。但是到目前为止，MMP-12在肾细胞癌中的表达模式以及与肿瘤侵袭和转移的关系仍未见报道。因此，在本研究中我们检测了肾细胞癌和正常组织中MMP-12的表达水平，使用统计学分析其表达差异以及与肾细胞癌侵袭和转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

在知情同意的原则下，取2012-2013年确诊的肾细胞患者50例，所有病例在采血前均未接受过任何放疗、生物或免疫治疗。所选取的肾细胞癌的病理诊断均经过两位高年资病理医生确认。正常组织标本来源于16例经手术的肾非肿瘤病例。

主要试剂和仪器：Trizol试剂；Fermentas反转录试剂盒；TAKARA实时荧光定量试剂盒；ABI 7500实时荧光定量系统。MMP-12及GAPDH实时荧光定量PCR引物使用primer 5设计，全部引物均在北京奥科公司合成。

1.2 组织标本收取及保存

常规于术后10 min内在大体肿瘤标本以及经手术的非肿瘤病例标本中切取部分标本放于冻存管中，所有标本经液氮冷冻后放于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 总RNA提取和反转录

使用Trizol(Invitrogen)进行样本中RNA的提取，在100 mg肿瘤及正常组织中分别加入预冷的Trizol Reagent 1 mL，匀浆后加入200 μL氯仿混匀，振荡后静置2 min；1.2×104g、4 ℃离心15 min后小心吸取上清，转移至另一EP管后加入500 μL异丙醇，混匀后-20 °C过夜；第2天经1.2×104g、4 ℃离心10 min后弃去上清，向沉淀中加入等体积的75%乙醇洗涤沉淀；1.2×104g、4 ℃离心20 min后弃去乙醇，室温干燥10 min，所得RNA溶解于20 μL DEPC处理水，紫外分光光度计定量。每个总RNA样品取5 μg，加入50 μmol/L oligo(dT)18 Primer 1 μL，加DEPC处理水至12 μL，70 ℃加热5 min，冰上放置5 min 后，依次加入10 mmol/L dNTP混合液2 μL，5×reaction buffer 4 μL，20 u/μL Ribolock inhibitor 1 μL，混匀后37 ℃加热5 min，加入200 u/μL Revert Aid M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，42 ℃反应60 min，70 ℃加热10 min中止反应。

1.4 实时荧光定量PCR

使用ABI 7500型实时定量PCR仪。每种组织模板均加入MMP-12和内参照GAPDH对应的荧光定量PCR引物，其中MMP-12引物为5′-CGATGAGGAC GAATTCTGGACTAC-3′和5′-GGTTCTGAATTGTCAGG ATTTGGC-3′；内参照GAPDH引物为5′-CCCATCACC ATCTTCCAGGAGCG-3′和5′-GGCAGGGATGATGTT CTGGAGAGCC-3′。实时荧光定量PCR反应体系为25 μL,其中dNTP(2.5 pmol/μL)2 μL,上、下游引物各1 μL，MIX酶12.5 μL，cDNA 模板1 μL，SYBR 0.5 μL，去离子水补至25 μL，每个样品均设1个复孔。在ABI 7500荧光定量PCR仪上按下列条件扩增：95 ℃ 10 s预变性，然后95 ℃ 10 s，60 ℃34 s，共45个循环。程序设定在每一个循环的变性期后，记录上一循环最后10%的平均荧光值，以表示PCR产物含量。反应完成后调整基线循环和计算域值，采用2-ΔΔCt法比较NDRG1的相对表达量，仪器自动根据得出的Ct计算得出代表相对表达量的RQ值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 MMP-12在肾细胞癌和正常肾组织中的表达

经过相对表达计算，肾细胞癌组织中MMP-12的相对表达量为3.58±0.36，正常肾组织中MMP-12的相对表达量为1.06±0.12，两者相比具有统计学差异(P<0.001)。说明肾细胞癌中MMP-12的表达量显著高于正常肾组织，MMP-12在肾细胞癌的发生过程中有可能起到促癌作用。

2.2 肾细胞癌中MMP-12表达与肿瘤侵袭转移的关系

通过回顾50例肾细胞癌的临床资料，将肿瘤根据不同的侵袭或转移程度分组，使用统计学分析检测各组中MMP-12表达的差异。结果显示，高侵袭力肾细胞癌组织中的MMP-12表达显著高于低侵袭力肾细胞癌(P<0.001)；有淋巴结转移的肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于无淋巴结转移者(P<0.001)；有远处转移的肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于无远处转移者(P<0.001)(表1)。说明MMP-12在肾细胞中可能发挥促进肿瘤侵袭和转移的作用。

表 1 肾细胞癌中MMP-12的表达与肿瘤侵袭转移的关系

3 讨 论

由于MMP-12最初是在人肺泡中被发现的，早期的研究主要局限于呼吸系统，研究发现MMP-12的高表达是慢性阻塞性肺疾病发病的关键分子要素之一。随后，由于MMP-12具有广泛的细胞外基质降解作用，对其的研究逐步扩展到肿瘤领域，先后有研究发现MMP-12在食管癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌中表达显著高于相应正常组织，而且在这些肿瘤中，MMP-12的表达与肿瘤的侵袭转移密切相关[7-8]。但是，截至目前，仍未见MMP-12在肾细胞癌中的研究报道。本研究系统检测了肾细胞癌组织中MMP-12的表达，结果显示肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于正常组织，说明MMP-12在肾细胞癌的发生过程中可能发挥促癌作用。除此之外，通过回顾临床资料并进行统计学分析，我们发现高侵袭力肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于低侵袭力肿瘤；有淋巴结转移的肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于无淋巴结转移者；有远处转移的肾细胞癌组织中MMP-12的表达显著高于无转移者(P<0.001)，说明MMP-12可能促进肾细胞癌的侵袭转移。以上研究结果说明,MMP-12在肾细胞癌中有望作为肿瘤早期诊断和侵袭转移的生物标志物，进而为肾细胞癌的早期诊断和个体化治疗提供具有临床价值的线索。

[1] Jemal A,Bray F,Center M M,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[3] Pytliak M,Vargová V,Mechírová V.Matrix metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review[J].Onkologie.2012,35(1/2):49-53.

[4] Peng Wenjia,Yan Junwei,Wan Yanan,et al.Matrix metalloproteinases:a review of their structure and role in systemic sclerosis[J].J Clin Immunol,2012,32(6):1409-1414.

[5] Di Carlo A.Matrix metalloproteinase-2 and -9 in the sera and in the urine of human oncocytoma and renal cell carcinoma[J].Oncol Rep,2012,28(3):1051-1056.

[6] Dandachi N G,Shapiro S D.A protean protease:MMP-12 fights viruses as a protease and a transcription factor[J].Nat Med,2014,20(5):470-472.

[7] Marchant D J,Bellac C L,Moraes T J.A new transcriptional role for matrix metalloproteinase-12 in antiviral immunity[J].Nat Med,2014,20(5):493-502.

[8] Chang Wenjun,Du Yan,Zhao Xin,et al.Inflammation-related factors predicting prognosis of gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2014,20(16):4586-4596.