钨磷酸盐联合表阿霉素抑制K562细胞增殖

宫 丹，钟 越，曹红梅，韩丽琴，王长文，赵文秀* (.解放军第医院血液肿瘤科,吉林 吉林 30；.吉林医药学院，吉林 吉林 303)

表阿霉素(Epirubicin，EPI)和阿霉素(Adriamy cin,ADR)是多种肿瘤的一线化疗药物，主要用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌和肝癌等肿瘤的治疗。EPI和ADR均具有剂量依赖的心脏毒性，减少其用量可减少其心脏毒副性[1]。钨磷酸盐(K6[P2W18O62]·14H2O)为课题组合成的抗肿瘤多酸，对卵巢癌、乳腺癌和白血病等肿瘤具有抑制作用[2]。本研究采用钨磷酸盐与EPI联合处理白雪病细胞K562，分析钨磷酸盐对细胞内化EPI，以及抗肿瘤效应的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

白血病细胞K562冻存液氮中。钨磷酸盐(K6[P2W18O62]·14H2O)由本课题组合成和晶体结构表征，纯度为93.7%。表阿霉素注射液为无锡辉瑞制药有限公司产品。活性氧探针双氯荧光黄乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)和WST-1购自碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养与药物处理

复苏K562细胞,用在含10%小牛血清的1640培养液、37 ℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养。每周传代3次，取对数生长期细胞用于实验。调细胞密度为4×104/mL,按每孔100 μL接种96孔培养板；用培养液稀释钨磷酸盐(K6[P2W18O62]·14H2O)和表阿霉素，并加入各孔；在不同浓度钨磷酸盐(0和12.5 μmol/L)和表阿霉素(0、2.5、5和100 μmol/L)处理细胞72 h后，WST-1还原法检测细胞增殖。调细胞密度为4×104/mL,按每瓶10 mL接种细胞于培养瓶，不同浓度钨磷酸盐(0、25、50和100 μmol/L)和表阿霉素(0、2.5、5和10 μmol/L)处理细胞24 h后收集细胞，流式细胞术检测细胞内活性氧、细胞内表阿霉素相对含量和细胞凋亡。

1.3 细胞增殖分析

参照文献方法，检测细胞增殖：取96孔板，按每孔10 μL加入WST-1溶液，37 ℃孵育2 h后，酶标分析仪检测450 nm吸光度值并计算细胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)[3]。

1.4 细胞内活性氧检测

收集细胞后用PBS调至密度为2×106/mL的细胞悬液，取500 μL细胞悬液，加入DCFH-DA储存液，至其终浓度为5 μmol/L，混匀后在37 ℃避光反应30 min，PBS洗2次后用流式细胞仪分析。

1.5 表阿霉素相对含量分析

参照文献，本研究利用ADR发射的红色荧光，分析细胞ADR的相对含量[4]。

2 结 果

2.1 钨磷酸盐和表阿霉素对K562细胞增殖的影响

不同浓度钨磷酸盐和表阿霉素处理72 h，对K562细胞的增殖抑制率见表1。12.5 μmol/L的钨磷酸盐单独作用对K562细胞仅有较弱的抑制作用，但与表阿霉素联合作用，可显著提高抗肿瘤效应。参照文献，采用金正均法计算钨磷酸盐与表阿霉素的联合指数[4]。12.5 μmol/L钨磷酸盐与2.5、5和10 μmol/L表阿霉素的联合指数分别为1.62、1.29和1.02，计算结果表明钨磷酸盐与2.5和5 μmol/L的EPI具有联合作用，而与10 μmol/L表阿霉素具有加合作用。

2.2 钨磷酸盐促进K562细胞内化表阿霉素

阿霉素和表阿霉素发射红色光，采用流式细胞仪检测细胞内荧光，参照文献方法用F2通道的平均荧光强度值代表细胞内表阿霉素的相对含量。结果表明，12.5 μmol/L的钨磷酸盐可促进阿霉素进入K562细胞内(表2)。

表 1 钨磷酸盐和表阿霉素对K562细胞增殖的影响

表 2 钨磷酸盐和表阿霉素对K562细胞内化阿霉素的影响

2.3 钨磷酸盐和表阿霉素对K562细胞活性氧影响

DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，该物质被氧化后生成DCF，而DCF发射的荧光可采用流式细胞仪525 nm通道(FL1)来检测,其荧光强度值代表细胞内ROS水平。分析表明，钨磷酸盐和表阿霉素联合处理组细胞ROS含量低于表阿霉素单独作用组(表3)。

表 3 钨磷酸盐和表阿霉素对K562细胞ROS含量的影响

3 讨 论

EPI是临床常用的蒽环类抗肿瘤药物(anthracy cline,ATC),但该药有剂量累积心脏毒性。体外实验也发现高浓度的EPI对培养的心肌细胞和血管内皮细胞有损伤作用，而降低EPI浓度，则损伤作用减轻。近年来,国内外在EPI心脏毒性方面进行了一定的探索,发现还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等氧自由基清除剂对其引起的心脏毒性有保护作用[2]。多酸化合物又称多金属氧酸盐(Polyoxometalates),是一类金属-氧簇合物。1971年,Raynaud等首次报道钨硅杂多酸盐具有抑制小鼠白血病肉瘤病毒的作用。此后,多酸化合物除传统地被用作化学合成的催化剂外,部分多酸化合物因具有抗肿瘤和抗病毒作用,引起医药领域的重视[5]。本课题组参照文献合成Dawson结构钨磷酸钾盐化合物[7],其结构式为K6[P2W18O62]·14H2O,采用肿瘤细胞系体外培养模型,发现其对多种抗肿瘤具有抑制作用，并可促表阿霉素诱导细胞凋亡。在此基础上，本研究探讨低浓度的K6[P2W18O62]·14H2O与EPI联合抗肿瘤的效应和机制。

通过研究发现，钨磷酸盐(15 μmol/L)与阿霉素(2.5、5和10μ mol/L)的联合指数分别为1.62和1.29，即两者具有协同抗肿瘤效应；钨磷酸盐可促进阿霉素内化入细胞并降低细胞内活性氧水平。因此，钨磷酸盐可能通过促进表阿霉素内化入细胞而发挥协同抗肿瘤的作用。值得注意的是，在获得相同抗肿瘤效应下，钨磷酸盐可降低EPI的用量，并降低细胞内活性氧的含量。蒽环类抗肿瘤药物类抗癌药物的心脏毒性为剂量依赖、机制与细胞内活性氧量过高导致的线粒体功能下降有关[6]。本研究发现钨磷酸盐与阿霉素协同效应，并初步研究了其两者联合对细胞内活性氧的降低效应，值得进一步补充体内外研究，深入探讨其作用机理和应用价值。

参考文献：

[1] Elalouani C,Benhmidoun M A,Rida H,et al.Short and medium term cardiotoxicity of anthracyclins:a prospectivestudy[J].Ann Cardiol Angeiol (Paris),2012,61(4):257-266.

[2] 赵文秀，李 妍，董顺福，等.K6[P2W18O62]·14H2O抑制人乳腺癌细胞MCF-7生长的体外研究[J].中国药房,2009,20(7)：509-511.

[3] Wang Jun,Chen Baoan,Chen Jian,et al.Synthesis and antitumor efficacy of daunorubicin-loaded magnetic nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2011,6:203-211.

[4] 孙德一,张 铎,王海杰,等.流式细胞术分析五味子乙素促进阿霉素内化的实验研究[J].中国科技信息,2012(7)：151-152.

[5] 钟绍鹏,陈建秋,沈卫阳.多酸化合物在药学领域的应用研究近况[J].药学进展,2010,34(10)：449-456.

[6] Toldo S,Goehe R W,Lotrionte M,et al.Comparative cardiac toxicity of anthracyclines in vitro and in vivo in the mouse[J].PLoS One,2013,8(3):e58421.