ER-α36基因沉默对ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其影响

李东阳,王白石,崔桂花,罗 速 (.天津市泰达医院检验科,天津 00457;.天津医科大学中新生态城医院检验科,天津 00467;.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 0;4.北华大学基础医学院，吉林 吉林 0)

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。随着脂肪类食物摄入增多，女性行经期的延长，内分泌紊乱增加等因素乳腺癌的发病率逐年升高。乳腺癌的发病机制复杂，影响因素多，病因尚不明确[1-3]。乳腺癌研究表明,雌激素受体存在使激素类信号的很多功能可以在荷尔蒙敏感的组织中发挥作用，可见雌激素受体在乳腺癌的发生、发展中起关键性作用[4-8]。根据乳腺癌细胞中ER-α66可分为雌激素受体阳性的激素依赖性乳腺癌和雌激素受体阴性的激素非依赖性乳腺癌[9-11]。ER-α66对人乳腺癌患者预后的判定及治疗方案的设定起着至关重要的作用。

2006年美籍华人王兆一教授[12]克隆出一种ER-α66的剪接变体，命名ER-α36；发现证实ER-α36的功能不同与ER-α66对雌激素信号的影响[12-13]。ER-α36它主要存在于细胞膜上，并且能与雌激素和抗雌激素药物相互作用，通过MAPK/ERK和PI3K等相关信号传导通路，刺激细胞的增殖[14]。它的发现不难解释抗雌激素药物治疗出现耐药并且恶化的情况。本研究利用RNA干扰技术，以探讨ER-α36基因与ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的内在联系。

1 材料与方法

1.1 主要材料及来源

siRNA模板序列和引物(上海生工合成)；MDA-MB-231细胞株(东北师大生命科学院研究室赠)；载体质粒pRNAT-U6.1/Neo、ER-α36一抗(美国王兆一教授研究室赠)；RT-PCR kit、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、质粒DNA小量纯化试剂盒、核酸内切酶HindⅢ、核酸内切酶BamHⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶(均购自大连宝生物工程公司)；lipofeetamineTM2000(Invitrogen公司)；RPMI-1640培养基、TBD血清(北京鼎国生物技术公司)。

1.2 RNAi质粒的设计、构建和鉴定

1.2.1 RNAi序列的设计

根据GenBank中ER-α(NC_005100)的cDNA序列及美国王兆一教授克隆的ER-α36 cDNA的已知序列，选择不匹配区域，按小干扰载体的设计原则，寻找符合特征的靶序列。合成针对其编码区4560-4780碱基序列的两条DNA寡核苷酸链,用Blast软件进行序列同源性分析,并用RNA structure 3.7软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括21个特异的正义链和与其互补的21个反义链,正反链之间有10个碱基的Loop(TTGATATCCG)间隔,正义链之后有6个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入BamHⅠ及HindⅢ酶切位点。针对目的基因ER-α36的序列5′-CTGGACCAGTGCAAGATTAAA-3′设计DNA双链，命名为ER-α36-siRNA；同法构建阴性质粒作为对照序列5′-GTACCAGCTAGACCATCAT-3′的DNA双链，命名为control-siRNA。本研究构建的ER-α36干扰序列如下，序列由上海生工合成，两条互补寡核苷酸链退火，形成互补双链结构，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

ER-α36-siRNA1正义链:GATCCCGTTTAATCTTGCAC

TGGTCCAGTTGATATCCGCTGGACCAGTGCAAG

ATTAAATTTTTTCCAAA

ER-α36-siRNA1反义链:AGCTTTGGAAAAAATTTAA

TCTTGCACTGGTCCAGCGGATATCAACTCCACC

AGTGCAAGATTAAACGG

ER-α36-siRNA2正义链:GATCCATGATGGTCTAGCT

GGTAGGCTTCAAGAGAGCCTACCAGCTAGACCA

TCATTTTTTTA

ER-α36-siRNA2反义链:AGCTTAAAAAAATGATCCT

CTAGCTGGTAGGCCTCTCTTGAAGCCTACCAGC

TAGACCATCATG

1.2.2 RNAi质粒的构建及提取鉴定

利用分子克隆的方法先将载体质粒pRNAT-U6.1/Neo线性化、回收。再用T4连接酶，16 ℃水浴将目的序列与线性化载体过夜连接，构建siRNA重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA。并将连接产物转化到感受态细胞获得重组菌。挑选阳性克隆，培养并制备质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，将酶切鉴定正确的克隆送上海生工完成测序。成功构建的重组菌大规模扩增后用去内毒素的质粒DNA制备试剂盒按说明书步骤提取质粒，-80 ℃保存。

1.3 RNAi重组质粒对ER-α36基因的抑制效应

1.3.1 MDA-MB-231细胞培养

培养液(RPMI1640含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，轻吹混匀，移入培养瓶内，加足培养液在37 ℃，5%CO2孵箱中培养。

1.3.2 RNAi质粒转染MDA-MB-231细胞

转染前细胞处于对数生长期，胰酶消化，并离心收集细胞，细胞计数，1×105/孔接种24孔板，每孔500 μL无血清无抗生素的培养液。用脂质体LipofectamineTM2000进行转染。按说明书的比例，24孔板，细胞培养液500 μL，DNA 0.8 μg,LipofectamineTM2000 2.0 μL。将阴性对照质粒和ER-α36基因重组质粒分别转染细胞MDA-MB-231中，转染6 h后，更换含有血清的全培养基，在37 ℃ 5%CO2培养箱中培养18～48 h,待转染后48 h荧光显微镜观察转染效率。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖

本实验分三组，未转染的MDA-MB-231作为空白对照组，阴性重组质粒转染的MDA-MB-231为阴性对照组,ER-α36基因重组质粒转染的MDA-MB-231为hER-α36-siRNA组。每组细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配置单细胞悬液，接种到96孔板(每孔200 μL，细胞密度调至103～104/孔)，每组12个孔重复，实验重复3次。37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。将各孔在24 h、48 h、72 h分别加入浓度为5 g/L MTT 20 μL，温箱孵育4 h，轻轻吸去培养液。加入150 μL的DMSO，微振荡器上振荡10 min，酶联检测仪上测定波长570 nm光的吸光度(A)值。按公式抑制率%=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值×100%计算各组抑制率，抑制率>30%即对该药敏感性高。

1.3.4 检测ER-α36基因mRNA转录水平

遵循PCR引物设计原则，根据美国王兆一教授的ER-α36基因cDNA序列，设计两条引物，扩增序列长度为909 bp，以β-actin作为内参对照,扩增序列长度为661 bp。由上海生物工程公司合成。利用RT-PCR分别检测三组基因的mRNA转录水平，利用图像分析程序，读取图像各条带的灰度，从而对细胞的DNA含量进行定量比较。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA重组质粒的测序鉴定

将目的片段与pRNAT-U6.1/Neo载体连接的阳性克隆测序,测得DNA序列证实含有目的片段序列(第403～423个碱基),表示质粒构建成功，测序见图1。

图 1 DNA测序图

2.2 重组质粒对乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响

2.2.1 重组质粒瞬时转染效率

将重组质粒用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒分别转染在24孔板内生长的MDA-MB-231细胞中，倒置荧光显微镜下，对照组细胞生长状况良好，多为梭形，大小适中，核仁清晰，可见核分裂相；pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA使MDA-MB-231细胞数量明显减少，形态不规则，细胞皱缩，颗粒增多，细胞碎片增加。转染48 h后通过绿色荧光蛋白(GFP)在荧光显微镜下观察转染阳性细胞，转染效率可达70%，见图2。

荧光显微镜(×100) 显微镜(×100)

2.2.2 重组质粒抑制MDA-MB-231的作用

MTT法检测MDA-MB-231细胞24-72 h生长，发现pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA重组质粒能显著抑制MDA-MB-231细胞增殖,见图3。

2.2.3 ER-α36在MDA-MB-231中的mRNA含量

一定循环数范围内,扩增产物的产量和扩增循环数之间有良好的线性关系。我们选择此范围内的28个循环为最佳扩增循环数。将构建的pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36 siRNA表达载体及阴性对照载体转染MB-MDA-231细胞,如图4所示,可见载体有抑制效果。以β-actin为内参，与未转染的MB-MDA-231空白对照组和阴性对照组相比抑制效率为86.3%和84.2%，P<0.01,如图5所示。

图 3 MTT测定细胞生长曲线

图 4 MB-MDA-231细胞ER-α36mRNA表达

图 5 转染MB-MDA-231对ER-α36 mRNA表达影响

3 讨 论

3.1 小干扰序列设计

根据GenBank中ER-α(NC_005100)的ER基因寡核苷酸序列,及美国王兆一教授克隆的ER-α36的cDNA序列[12]，按照Qiagen公司提出的RNAi设计原则[15]：(1)在mRNA的编码区选择21～23nt的序列，序列中GC含量尽量接近50%，最佳GC比例在45%～55%之间。尽量不要超过60%，高于70%的话，任何序列的作用效果都要受到严重影响。本实验GC含量达到54%。(2)在同一序列中尽量避免连续3个以上的鸟嘌呤出现，polyG序列可以重叠形成块状结果，严重影响siRNA的作用效果。(3)优先选择AA起始的序列，这样可以提高siRNA对核苷酸酶的抵抗性。(4)通过BLAST软件确保所选片段与任何已知基因无同源性。基于上述原则本实验设计出沉默ER-α36基因表达的RNAi序列。交由上海生工合成上、下游引物。通过引物的退火条件成功合成带有粘性末端的小干扰DNA序列。

3.2 siRNA载体构建

双酶切、PCR及测序结果均证实重组质粒即为克隆含目的序列的重组质粒。重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA的构建成功为后续实验打下基础。本实验应用pRNAT-U6.1/Neo作为载体构建小干扰重组质粒，在真核细胞中表达,其U6启动子位于编码序列的上游,能够启动多克隆位点上的目的shRNA转录,最大的优点是可以精确地起始和终止RNA转录,且表达量丰富[16]。其CMV启动子启动GFP(绿色荧光蛋白)转录,便于观察载体转染细胞的效率,优化转染条件。含有新霉素抗性基因(Neo),可以由G-418筛选得到稳定表达shRNA的细胞;含有可以进行长期基因沉默的氨苄抗性基因(Amp),能在含有氨苄青霉素的LB培养基中大量扩增。应用该质粒能够有效、持久地产生针对靶基因的shRNA，并且便于检测。从而有助于更精确评价抑制靶基因的效果。

3.3 重组质粒干扰沉默ER-α36对MDA-MB-231细胞的影响

3.3.1 小干扰重组质粒转染MDA-MB-231细胞

荧光显微镜观察结果显示，转染的MDA-MB-231细胞中可以观察到一定量绿色荧光蛋白。因此可以认为转染的重组质粒在细胞中有较高的表达量。本实验应用转染试剂为脂质体LipofectamineTM2000。该转染试剂是最新一代的转染试剂代表，具有高转染率、高检出率、低细胞毒性等特点。通过荧光显微镜对重组质粒转染的MDA-MB-231细胞进行观察，与未转染重组质粒的细胞进行对照。由于GFP基因在细胞内表达(非分泌蛋白)，在紫外光激发下发绿色荧光，便于观察转染效率、操作简捷、快速，为下一步实验打下基础。

3.3.2 瞬时转染后细胞增殖情况

细胞水平上，本实验采用MTT法，检测出pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36-siRNA转染入细胞MDA-MB-231，分别检测到24 h、48 h及72 h细胞增殖情况，随时间增加，抑制效率逐步增强(时间观察点72 h抑制强度达到最大74.4%)，表明ER-α36基因沉默对细胞的增殖有明显抑制作用，提示ER-α36通过MAPK/ERK信号转导通路参与雌激素受体阴性乳腺癌的细胞增殖，在雌激素受体阴性乳腺癌细胞的发生发展中可能发挥重要作用。其作用机制和相关因子还需进一步研究。

3.3.3 ER-α36在细胞中mRNA含量的检测

转录水平上，本实验通过RT-PCR法设计ER-α36的特异引物，以β-actin为内参对照，结果显示ER-α36-siRNA组表达明显下降。说明该重组质粒转染细胞后可有效抑制雌激素受体阴性乳腺癌细胞中ER-α36基因的表达。本实验从转录水平小干扰有效抑制了ER-α36的表达，为雌激素受体阴性乳腺癌的治疗提供了新的实验和理论依据。

综上所述，本实验将ER-α36作为“靶”,RNAi技术作为“箭”，首次应用小干扰技术在雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中对ER-α36进行了研究。初步探讨了ER-α36基因在雌激素受体阴性乳腺癌发生、发展中的作用机制,及ER-α36的信号转导途径(MPAK/EAK)[17]与雌激素受体阴性乳腺癌的相关性问题。ER-α36作为雌激素受体调控的重要组成部分之一，和其他雌激素受体相比，与雌激素受体阴性乳腺癌的关系更为密切。ER-α36可能成为雌激素受体阴性乳腺癌基因治疗的新靶点。

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