中药Ⅰ号方对APP/PS1双转基因模型小鼠APP代谢的影响

隋小龙，梁良，张玲，朱华，徐艳峰，黄澜，徐玉环，韩云林，姚志刚，秦川，邓巍

(中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人中最常见的痴呆类型，临床上以进行性认知功能损害和严重的神经功能下降为特点[1]。关于这种疾病的发病假说有很多种，其中较为接受的是Aβ级联假说，该假说认为淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)代谢产生的Aβ是AD的触发因素。APP是一种I型跨膜蛋白，氨基端在胞外，羧基端在胞内。APP有两种代谢途径，一个是淀粉样蛋白(Aβ)生成途径，另一个是抗Aβ生成途径。在抗Aβ生成途径中，APP被α分泌酶分解为sAPPα(soluble APPα)和α-CTF(α-carboxyl terminal fragment, C83)，α-CTF进一步被γ分泌酶分解为p3和AICD(APP intracellular domain)；在Aβ生成途径中，APP先被β分泌酶(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)分解为sAPPβ(soluble APPβ)和β-CTF(β-carboxyl terminal fragment, C99)，β-CTF进一步被γ分泌酶分解为Aβ和AICD[2]。α分泌酶现在已经发现主要有ADAM10、 ADAM17和 ADAM9[3]，其中ADAM10是在脑内起主要作用[4]。本实验室前期研究发现，PN-1显著提高模型鼠在新物体识别和Morris水迷宫中的表现；能够减少模型鼠脑内老年斑(senile plaque, SP)沉积并能够降低脑内Aβ水平[5]，改善模型小鼠的社会交互行为，提高其耐力和平衡学习能力，并减轻其焦虑、烦躁、易激怒等精神状况[6]。本文将进一步探索PN-1在影响Aβ生成过程中的作用机制，以期为PN-1的进一步临床推广应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

Western blot所用的仪器为凯元Mini P-4小型垂直电泳槽及Mini TBC湿式转印槽，转印的PVDF膜(0.22 μm/0.45 μm)购自Millipore(ISEQ00010/IPVH00010)；检测抗体为：抗人sAPPβ野生型兔IgG (1∶50，IBL，18957); APP-C端单克隆抗体(1∶500，Convance, SIG-39152); Aβ1-16 (6E10)单克隆抗体(1∶1000，Covance, IG-39320); Aβ4G8单克隆抗体(1∶1000，covance，SIG-392007); 抗ADAM10抗体(1∶1000，Abcam，ab1997); 抗BACE1抗体(1∶1000，Abcam, ab2077); DAPI包埋剂(ZSGB，ZLI-9557)；HRP标记β-actin抗体和HRP标记GAPDH抗体(1∶10000，康成生物，KC-5A08，KC5G5)；FITC标记山羊抗小鼠IgG(ZSGB, ZF-0312); RIPA裂解液(强)(碧云天生物，P0013B)；超敏二步法免疫组化检测试剂盒(ZSGB，pv-9001)。

1.2 中药

中药I号方由20余味中药组成，主要成分为黄芪、党参、白术和肉苁蓉，按照干重8∶2∶3∶2炮制。其粉剂用蒸馏水煮沸3次，每次30 min。将上清液合并调整至生药浓度为1 g/mL，使用时稀释至0.1 g/mL。本实验中的给药浓度均折合成生药质量进行计算。

1.3 实验动物

实验中所用到的APP/PS1双转基因模型小鼠由本所自己构建，模型以C57BL/6J小鼠为背景，为含有人APP瑞典(Swedish)突变(K595N/M596L)和人PS1敲除了第九个外显子的双转基因小鼠[7]。实验在中国医学科学院医学实验动物所进行 [SYSK(京)2011-0022]。

1.4 分组及给药

5月龄APP/PS1双转基因小鼠80只，根据体重随机分为模型组、PN-1低剂量组(0.6 g/kg)，PN-1中剂量组(1.2 g/kg)和PN-1高剂量组(2.4 g/kg)，并以同窝阴性的C57BL/6J小鼠为正常对照组，每组16只，雌雄各半。给药组小鼠每天灌胃给药1次，同时模型组及正常组小鼠均给予等体积双蒸水灌胃，给药持续4个月。

1.5 Western Blot检测APP代谢相关分子

将给药结束后的小鼠颈椎脱臼处死，将左半脑存于-80℃，另一半加入1 mLRIPA裂解液(碧云天公司)提取蛋白，BCA法(Pierce公司, Pierce BCA Kit试剂盒)测定蛋白浓度。每组取6只动物，每个样本取70 μg后用4×加样缓冲液loading buffer 和生理盐水补齐至20 μL，100℃变性5min后，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，用对应的一抗杂交4℃过夜。次日TBST洗后，用对应的二抗室温杂交1 h，TBS洗后ECL曝光、显影和定影。然后用 Image J 分析灰度，此灰度值代表蛋白相对量。

1.6 免疫组化及免疫荧光

1.6.1 免疫组化

①常规石蜡切片经过脱蜡、水化和抗原修复后，PBS(pH=7.4)冲洗(5 min，3次)；②灭活内源性过氧化氢，10 min后PBS冲洗(5 min, 3次)；③加入羊血清工作液封闭30 min；④滴加一抗(应用抗体稀释液稀释)，4℃过夜；⑤PBS冲洗(5 min，3次)后，加入一抗种属对应的免疫组化试剂盒中的试剂1，孵育15 min后，PBS冲洗(5 min，3次)，滴加试剂2，孵育15 min后，PBS冲洗(5 min，3次)；⑥DAB显色，显微镜控制，调整各组抗体显色时间最佳而且一致，PSB冲洗10 min，蒸馏水冲洗10 min；⑦苏木素复染，冲洗，脱水，透明，中性树胶封固，镜检。显微镜观察，阳性产物呈棕褐色，阴性对照组无变化。阴性对照组用PBS代替一抗，其与步骤同上。

1.6.2 免疫荧光

免疫荧光同免疫组化的方法大致相同，①同上；②加入羊血清工作液封闭30 min；③滴加一抗(应用抗体稀释液稀释)，4℃过夜；④PBS冲洗(5 min，3次)后，加入绿色荧光标记的二抗(1∶200，PBS稀释)，室温孵育30 min；⑤PBS冲洗(5 min，3次)后，用含DAPI的水溶性封片剂封固后，镜下观察。

免疫组化及荧光的结果均采用Image-Pro Plus(5.1.0.20)分析其累计光密度、面积和计数。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 中药Ⅰ号方对APP的影响

正常对照组(WT)为非转基因小鼠，无明显条带，模型组(vehicle)与低、中、高(0.6、1.2、2.4)给药组的APP没有明显差异(图1)。

注：一抗为6E10。#表示给药组与模型组相比，P>0.05。

2.2 中药Ⅰ号方对sAPPα的影响

相比于模型组，正常对照组检测不到sAPPα；给予中药后低、中、高剂量组sAPPα与模型组相比均明显降低(图1)。

2.3 中药Ⅰ号方对sAPPβ的影响

模型组与正常对照组相比，sAPPβ明显升高；而给予中药后低、中、高剂量组sAPPβ与模型组相比均明显降低，低、中、高剂量组间差异无显著性(图2)。

注：**表示给药组与模型组相比P<0.01。

2.4 中药Ⅰ号方对α-CTF和β-CTF的影响

正常对照组组中Western blot 不能检测出α-CTF和β-CTF；模型对照组与正常对照组相比，α-CTF和β-CTF明显升高；与模型组相比，给予中药后低、中、高剂量组α-CTF和β-CTF均明显降低，其中α-CTF降低到Western blot敏感性之下，低、中、高剂量组间α-CTF和β-CTF无差异(图3)。

注：*表示给药组和模型组相比，P<0.05; **表示与模型组相比，P<0.01。

2.5 中药Ⅰ号方对ADAM10的影响

Western blot结果中，模型组与正常对照组相比，ADAM10明显升高；而给予中药后，低、中、高剂量组ADAM10与模型组相比均明显降低，低、中、高剂量组间差异无显著性(图4)。

免疫组化结果中，ADAM10在全脑都有表达，给予中药后，低、中、高剂量组与模型组相比，ADAM10阳性细胞数量和光密度均明显降低，低、中、高剂量组间差异无显著性(图5，彩插4)。

2.6 中药Ⅰ号方对BACE1的影响

模型组与正常对照组相比，BACE1明显升高；而给予中药后低、中、高剂量组BACE1与模型组相比均明显降低，低、中、高剂量组间差异无显著性(图6)。

注：**表示给药组与模型组相比，P<0.01。

免疫组化结果中，脑内BACE1阳性的细胞为少数，但几乎遍布全脑，给予中药后，低、中、高剂量组与模型组相比，BACE1阳性细胞数量和光密度均明显降低，低、中、高剂量组间差异无显著性(图7，彩插4)。

2.7 中药Ⅰ号方对小鼠脑中老年斑的影响

与模型组相比，给药组(低、中、高剂量)动物脑内老年斑从数量和面积相比均减少，低、中、高剂量组间差异无显著性(图8，彩插5)。

3 讨论

AD是全世界老年人痴呆的首要原因，它以Aβ聚集形成SP和tau蛋白的高度磷酸化为特点[7]。AD的发病机制还尚未明确，关于AD的发病假说有很多种，其中Aβ级联假说较为人接受，该假说认为SP中的Aβ是引起AD病理过程中神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)、细胞丢失、血管病变的直接原因[8]。Aβ在体内沉积的原因很多，包括其生成增多、分解减少以及在脑实质、脑脊液和血浆之间的转移障碍[9]。目前对AD治疗的学术研究有针对乙酰胆碱酯酶(乙酰胆碱酯酶抑制剂，如美金刚)，Aβ(阻止或逆转hAPP/Aβ依赖的损害，如减少tau蛋白，cyclophilin D和Fyn；逆转 EphB2或Nav1.1的损害；将apoE4换为apoE3)和 tau蛋白等多种方法[10]，但还没有延缓或停止AD脑细胞恶化的药物。美国FDA批准了5种只能暂时延缓症状恶化的药物，而且只有少数的服药者能收到预期的效果[11]。抑制Aβ的生成被认为是AD的潜在治疗策略[12]。目前针对降低脑内Aβ负荷的策略有：1阻止Aβ的产生[13]；2增加Aβ的降解[14]；3免疫清除Aβ[15]。

本实验室前期研究发现PN-1能显著提高模型小鼠的记忆能力，能减少脑内的SP和Aβ，本文在此基础上完善了Aβ降低的机制。根据Aβ级联假说，Aβ是引起AD一系列病理过程的直接初始因素。本研究发现APP在模型组和给药组中没有明显差异，Aβ生成途径关键酶BACE1减少，Western blot和免疫组化结果一致，但各给药组间统计学变化不显著。BACE1在给药后受到抑制，导致APP分解产物β-CTF，sAPPβ的减少，SP也减少，前期结果中给药组比模型组的Aβ的减少[5]也证明了这一点，这就很好的解释了Aβ和SP减少的机制。与此同时，抗Aβ生成途径在给药后也受到了抑制，ADAM10，α-CTF和sAPPα在给药组中明显低于模型组，其中Western blot为整脑的组织匀浆，结果中低剂量组的ADAM10降低最明显，而免疫组化我们取ADAM10变化最明显的海马作为参照，中、高剂量组中ADAM10降低的程度略大于低剂量组，但两组数据中低、中、高剂量组间无统计学差异。PN-1的治疗使得APP分解的两条途径都受到了抑制(激活抗Aβ生成途径能增加APP通过α分泌酶途径的分解，减少其通过β分泌酶的量，从而减少Aβ的生成[16])，但减少的α分泌酶途径并没有影响APP通过β分泌酶分解减少(β-CTF、sAPPβ、Aβ及SP数量的降低)的总趋势，即PN-1在治疗PAP小鼠模型中有效。

中医药作为中华民族的传统医学维系了民族的繁衍与健康，为AD的治疗提供了希望。中医药成分复杂，关于中药单体的治疗探索也有很多，效果也是显著的[17]。复方中医药可能是多靶位治疗，中药Ⅰ号方由20余味中药组成，为AD的多靶位治疗提供了可能，可能比单一靶位治疗效果更好。如果能在PN-1成分基础上改动，或添加一些西药成分，增加α分泌酶的表达或活性，增加APP通过抗Aβ生成途径的分解[18]，这样就能更大程度上减少Aβ的生成和老年斑的沉积，从而收到更好的效果。

综上所述，PN-1能够同时抑制APP的α和β降解途径，显著降低Aβ的产生，为PN-1临床推广应用提供了理论基础。

(本文图5,7见彩插4,图8见彩插5。)

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