常用实验动物不同组织部位肥大细胞异质性的组织学特点比较

陈颖，朱萍妹，刘巧玲，潘华，周光兴

(复旦大学实验动物科学部，上海 200032)

肥大细胞(mast cell, MC)自报道以来，已被发现广泛存在于人和动物的多种组织器官内，在机体免疫反应、抗肿瘤、抗寄生虫感染反应及神经-体液-免疫调节通路中发挥着重要作用[1]。这些功能的实现源于MC内富含的多种生物活性介质和细胞因子，MC在外周组织发育成熟过程中，形成不同的细胞表型[2]，其形态、分布、所含介质种类和功能均存在明显的异质性(heterogeneity)。目前已有少量有关人及多种动物体内MC异质性的研究报道，但常用实验动物体内MC分布和功能的异质性至今未见系统报道，尤其对犬和猴MC的研究更为少见。本实验从MC分布、数量、形态、分型、超微结构及P物质免疫反应性等方面，对六种实验动物的皮肤、肺脏、乙状结肠和脾脏中的MC进行观察，首次对常用实验动物多种组织内MC进行了系统的比较组织学研究，以期为探讨不同实验动物MC的功能及意义提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级KM小鼠10只，体重18～22 g，1.5月龄；SPF级SD大鼠10只，体重150～250 g，2月龄。均购于复旦大学实验动物科学部[SCXK(沪)2009-0019]。清洁级Hartley豚鼠10只，体重800～1000 g，5月龄；清洁级新西兰兔10只，体重4～5 kg，6月龄。均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2012-0002]。普通级比格犬6只，体重7～10 kg，2岁；普通级食蟹猴6只，体重4～7 kg，5岁。均购于苏州西山中科实验动物有限公司[SCXK(苏)2012-0009]。以上动物均雌雄对半。小鼠、大鼠、豚鼠和兔的组织取材于复旦大学实验动物科学部动物实验设施内进行【SYXK(沪)2009-0082】，犬和猴的组织取材于苏州西山中科药物研究开发有限公司动物实验设施内进行【SYXK(苏)2011-0028】。常规麻醉后，取颈背部皮肤，立即打开胸腔、腹腔，取肺脏、脾脏和乙状结肠。组织固定后，作常规石蜡切片，行HE染色，部分动物作组化及免疫组化染色，光镜下观察。另取六种动物1 mm×1 mm×3 mm皮肤组织，作常规超薄切片，透射电镜观察。

1.1.2 主要试剂与仪器

甲苯胺蓝O、阿尔新蓝-8GX、藏红O购于生工生物工程(上海)股份有限公司；P物质(Substance P, SP)抗体购于美国Millipore公司；免疫组化试剂盒购于美国Santa Cruz公司；光学显微镜：Olympus-BX51；彩色病理图文分析系统：HPIAS-2000。

1.2 实验方法

1.2.1 组织化学染色

组织取材后固定于Bouin’s固定液24～48 h，常规石蜡切片，脱蜡至水，分别行甲苯胺蓝染色和阿尔新蓝-藏红染色。0.25%甲苯胺蓝染色1 min，稍水洗，0.5%冰醋酸分化，显微镜下控制，直至颗粒明显、背景清晰，蒸馏水冲洗；0.5%阿尔新蓝的3%冰醋酸溶液染色40 min，PBS冲洗后，0.25%藏红的盐酸溶液复染1 min，PBS冲洗。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学ABC法进行染色。取皮肤、脾脏组织固定于4%中性缓冲甲醛溶液，常规石蜡切片，脱蜡至水，3%甲醇-H2O2灭活内源性过氧化物酶，pH 6.0枸橼酸盐缓冲液高压抗原修复(120℃, 5 min)，0.5% TritonX-100细胞膜打孔，BSA封闭30 min，1∶100稀释的SP抗体4℃过夜，0.5%二抗、ABC复合物各37℃孵育30 min，DAB室温显色，镜下严格控制，阳性部位达到最强显色而背景无色时终止，苏木素复染后脱水、透明、封固，显微镜下观察并拍照。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 电镜切片染色

取皮肤组织立即投入2.5%磷酸缓冲戊二醛溶液预固定，1%锇酸溶液后固定，常规电镜脱水、包埋、固化，LKB-1型超薄切片机切片50～60 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，Phlips CM-120透射电镜观察，拍片。

1.2.4 MC计数及形态学参数分析

在甲苯胺蓝染色下对MC进行计数和形态学分析。对每只动物个体，连续随机计数10个高倍视野(×400)内MC数，取其平均值代表MC密度，对每种动物雌雄个体分别计数。使用彩色病理图像分析软件，分析MC面积、等效直径、核质比(细胞核在细胞中所占比例)和胞质灰度等参数。

1.2.5 统计分析

2 结果

2.1 HE染色

镜下观察结果显示，六种实验动物皮肤、肺脏、乙状结肠和脾脏等4种组织的形态层次清晰，结构完整，均未观察到变性、炎症、增生及坏死等异常病理改变，为正常组织，可用于组织化学、免疫组化染色及电镜观察。

2.2 甲苯胺蓝染色

皮肤组织中，六种动物MC分布于真皮层和皮下组织，表皮层无分布，多见于血管、淋巴管、毛囊、皮脂腺周围，胞质内充满紫红色粗大的异染颗粒，颗粒密集，有时占据整个细胞。小鼠MC体积较大，形态极不规则，可见长的细胞突起，且常可见脱颗粒形态的MC在真皮层及皮下组织中均匀分布。与小鼠相比，大鼠MC体积较小，形态较规则，有较大的淡蓝染的细胞核及亮点样细胞核，真皮层中分布较少，皮下组织中较多。豚鼠MC有短的细胞突起，在真皮层浅层较多，散在或串珠样分布。兔MC多为圆形或卵圆形，呈局部密集状分布，其他区域密度低，只见个别散在的MC。犬和猴MC多聚集或散在分布于真皮层，皮下组织中分布较少，犬MC体积小而胞核大，猴MC体积较大，细胞边界不清(图1，彩插8)。

肺组织中，六种动物MC主要分布于小叶间支气管、终末细支气管以及血管、淋巴组织周边，少量分布于肺间隔。六种动物的MC形态均可见圆形、椭圆形、梭形、三角形和不规则形态，胞质被染成紫红色或蓝紫色，胞核呈淡蓝色或不着色。小鼠MC形态最不规则，个别细胞可见短棒状突起，胞核较大，似空泡状，位于细胞中央。大鼠MC胞质着深染的紫红色，胞核淡蓝染或亮点状位于细胞中央或偏于一侧。豚鼠与兔的MC胞质淡染，部分MC着色偏蓝，呈蓝紫色，细胞边界不清，豚鼠MC主要分布在气管、血管周围，肺间隔中较少见到，而兔MC在肺间隔中分布较多。犬与猴的MC在肺脏中广泛分布，肺间隔中也较多见，犬的MC中可见巨大的细胞核，着淡蓝色，猴的MC形态较规则，胞核大小不一(图2，彩插8)。

乙状结肠中，六种动物MC主要见于黏膜固有层和黏膜下层，个别动物尚可见于肌层，犬和猴在浆膜层中亦可观察到MC，MC多沿血管、淋巴分布，或簇集成群，或排列成行，或单个散在出现。小鼠MC多小而圆，胞质为深染的蓝紫色，在黏膜固有层分布较多，黏膜下层分布不显著。大鼠MC胞质为深染的紫红色或蓝色，固有层中较少分布，多见于黏膜下层。豚鼠MC分布于固有层、黏膜下层，胞质深蓝染。兔MC形态似小鼠，胞质染蓝紫色，着色淡，在固有层中数量显著，黏膜下层分布较少，肌层偶见有分布。犬和猴的MC在黏膜固有层、黏膜下层、肌层和浆膜层均可见分布，胞质着紫红色或深蓝色。猴MC还可见于浆膜下层(图3，彩插9)。

脾脏内，MC主要分布于边缘区、红髓、被膜下与小梁周围，聚集呈簇，红髓内可见围绕脾血窦分布的MC，动脉周围淋巴鞘中偶见有MC分布，白髓淋巴小结中无MC。小鼠和兔MC形态较规则，呈圆形或椭圆形。小鼠MC胞质呈深染的紫红色，体积大的细胞边界不清，胞核淡蓝染或亮点状。兔MC胞质着蓝紫色，胞核位于细胞中央。犬MC形态多样，有的可见长短不一的突起，主要分布在边缘区。猴MC胞质被染成较淡的蓝紫色，胞核较大，形态与分布同犬。在该甲苯胺蓝染色方法下，未观察到大鼠和豚鼠的脾脏MC(图4，彩插9)。

2.3 阿尔新蓝-藏红(Alcian blue-safranin O, AB-S)染色

AB-S染色显示MC在皮肤、肺脏、乙状结肠、脾脏中的分布位置与甲苯胺蓝染色结果相同。在小鼠、大鼠、豚鼠和兔的皮肤中可见蓝染、红染和红蓝间染的MC，犬、猴的皮肤中仅观察到蓝染的MC。肺组织内，小鼠、大鼠MC呈蓝染、红蓝间染、红染三种，豚鼠、兔、犬、猴仅观察到到阿尔新蓝阳性的MC。脾脏与乙状结肠内，六种动物的MC均只见蓝染(图5，彩插9)。

2.4 SP免疫组化

经免疫组化染色的组织中，可见MC呈SP免疫反应性。细胞内阳性反应颗粒清晰，呈棕褐色，有时可见阳性颗粒充满整个细胞。其形态大小及分布特点与甲苯胺蓝染色基本一致。非SP阳性反应细胞为苏木素蓝染。小鼠皮肤中可见SP免疫反应阳性神经纤维，行走于MC附近，与MC邻接(图6a)。而犬脾脏中未见SP免疫反应阳性神经纤维(图6b)。对照组无阳性显色(见图6，彩插10)。

2.5 皮肤MC电镜观察

透射电镜下，小鼠、豚鼠、兔、犬和猴的皮肤MC均呈现椭圆形、梭形、狭长的条形或不规则的多边形。细胞表面可见短的伪足样突起。胞核多为肾形，位于细胞中央或偏于一侧，核仁明显，均可见常染色质和异染色质，异染色质贴附于核膜内侧。胞质内含少量线粒体、粗面内质网、游离核糖体及丰富的细胞骨架成分，除此之外可见数量不等、形态不一的胞质颗粒，颗粒有单位膜包裹。

小鼠MC胞质颗粒多呈圆形、椭圆形，少数呈短棒状或不规则形态。颗粒基质的电子密度均匀，未见特殊的亚微结构。根据颗粒电子密度的差异，小鼠皮肤MC可分为高电子密度、中等电子密度及低电子密度的均质状颗粒，低电子密度颗粒外的单位膜清晰可见(图7a)。豚鼠MC胞质颗粒形态同小鼠。颗粒基质呈绒毛状分布于颗粒内或呈斑状偏于颗粒一侧，也可见电子密度均匀的均质状颗粒，但个数极少(图7b)。兔MC颗粒多呈圆形，少部分呈椭圆形，颗粒大小差别显著。观察到斑状颗粒、低电子密度的均质状颗粒、空泡状颗粒(图7c)。犬MC颗粒呈现圆形、椭圆形，少数为不规则形态。颗粒基质呈现多种形态，除了有电子密度不等的均质状颗粒外，仍观察到多种特殊的颗粒亚微结构。如空泡状颗粒；同心圆状颗粒，其形态为高密度的圆形或椭圆形基质衬托在低密度均质中央；绒毛状颗粒；沙砾状颗粒以及斑状颗粒(图7d)。猴MC的颗粒形态与犬类似，但颗粒的亚微结构不如犬的复杂。将猴皮肤MC的胞质颗粒分为4种类型：I型为均质状颗粒，II型为沙砾状颗粒，III型为结晶状颗粒，IV型为空泡状颗粒(图7e)。

注：a、b、c、d、e分别为小鼠、豚鼠、兔、犬和猴皮肤MC超微结构。

2.6 MC计数比较

六种实验动物MC的数量在皮肤、肺脏及乙状结肠中差异均有显著性(P<0.05)，皮肤中小鼠和大鼠MC数量较多，肺组织中犬和猴MC数量较多，乙状结肠中兔、犬和猴MC数量较多。小鼠、兔、犬和猴脾脏MC数量差异有显著性(P<0.05)，犬MC数量较多。雌性犬皮肤MC数量多于雄性(P<0.05)，而肺组织中雄性犬MC数量多于雌性(P<0.01)，其余动物雌雄个体间差异无显著性(P>0.05)。

2.7 MC形态学参数比较

六种动物之间，皮肤、肺脏和乙状结肠组织中MC的面积、等效直径、核质比和胞质灰度差异均有显著性(P<0.05)，小鼠、兔、犬和猴的脾脏MC面积、核质比和胞质灰度差异均有显著性(P<0.05)，等效直径则无差异(表1～4)。

表1 六种实验动物皮肤MC参数分析±s)

表2 六种实验动物乙状结肠MC参数分析±s)

表3 六种实验动物肺脏MC参数分析±s)

表4 六种实验动物脾脏MC参数分析±s)

3 讨论

MC胞质颗粒富含多种生物活性介质和细胞因子[3]。颗粒内的组胺、肝素对碱性染料甲苯胺蓝具有异染性，可被染成蓝紫色，从而与周围细胞、组织区分。本实验甲苯胺蓝染色结果显示，MC在各种动物的每种组织中均存在形态学差异，但未观察到大鼠和豚鼠的脾脏MC，使用改良甲苯胺蓝染色法，或可增加MC的染出率。目前国内尚未有关于甲苯胺蓝染色效果差异性的报道，本实验发现六种动物乙状结肠中均可见数量不等的胞质呈深蓝染的MC，与其他部位胞质着紫红色的MC不同，表明甲苯胺蓝对于不同部位MC的着色有差别。不同动物的MC密度差别显著，同种动物雌雄个体间无差别，仅在犬的皮肤和肺脏中发现雌雄差异，由于统计个体较少，对此差异故暂不能下定论。本实验对象均为成年动物，年龄差异对MC的异质性是否有影响，仍需进一步实验研究。

根据颗粒介质种类的不同，动物MC分为结缔组织MC(CTMC)和黏膜MC(MMC)[2]。使用AB-S染色法能够区分含有不同颗粒种类的MC，藏红阳性者(红染)为颗粒内酸性黏多糖含硫量较高、以分泌肝素为主的成熟MC, Alcian蓝阳性者(蓝染)则为分泌组胺为主的未成熟的MC[4]。本实验在小鼠、大鼠、豚鼠和兔的皮肤MC，小鼠和大鼠的肺脏MC中观察到红染和红蓝间染的MC，表明在这些组织中存在以分泌肝素为主的MC，其他组织中则仅见以分泌组胺为主的阿尔新蓝阳性MC。虽然目前对AB-S染色技术在组织化学评价方面尚有争议，但本实验中相同条件下不同组织MC呈现着色差异，亦可在一定程度上说明MC颗粒介质的种类是存在差异的。有研究发现，病理状态下MC的着色性发生改变：小鼠急性缺氧致肺损伤的模型中，随着缺氧时间的延长，肺组织内红染、红蓝混染颗粒逐渐减少，蓝染颗粒逐渐增多[5]。

透射电镜观察显示豚鼠、犬和猴的皮肤MC颗粒均有特殊亚微结构。结果证实不同动物皮肤MC颗粒介质种类的确存在差异，但每种结构所表示的介质性质及意义，则仍需进一步研究。人MC胞质颗粒有旋涡状、颗粒状和结晶状特殊结构[6]，本实验在猴MC胞质颗粒内发现了和人相似的结晶状结构，提示猴与人MC在介质种类及功能上可能存在相似性。

SP免疫组化结果显示，在小鼠皮肤可见充满SP免疫阳性颗粒的MC及SP阳性免疫反应神经纤维，两者在位置上构成关联，位于真皮层浅层，与以往的报道相同[7]。在犬MC内可见SP免疫阳性的MC。神经纤维释放SP，以旁分泌的方式作用于与之相邻或形成突触连接的MC，引起MC脱颗粒，释放组胺等炎性介质[8]，使血管扩张、血浆溢出以及皮肤局部红肿、瘙痒，而组胺反作用于感觉神经，促使其形成SP经轴突反射由另一神经末梢释放[9]，SP亦作为痛觉传入递质向中枢传入痛觉信息。与此同时MC释放SP，一方面作用于MC自身，另一方面刺激淋巴细胞和抗体生成，引起局部免疫反应[10]。含SP的MC、神经纤维以及两者的形态联系，与增生性瘢痕[11]、特应性皮炎[12]、银屑病[13]等皮肤性疾病的病理发展相关。脾脏是免疫系统重要的器官之一，富含B淋巴细胞和T淋巴细胞，与甲苯胺蓝染色相比，犬脾脏内的MC大部分呈SP免疫反应阳性，SP(+)MC受神经调控脱颗粒释放SP，促进周围组织中淋巴细胞生成，对于免疫调节、维持宿主免疫防御和内环境稳态具有重要意义。

综上所述，本实验通过组织学、免疫学、细胞生物学和形态参数分析等指标，在国内首次系统比较了六种常用实验动物皮肤、肺脏、乙状结肠和脾脏中MC的组织形态学特点，结果显示并证实了MC在不同动物同一组织及同一种不同组织中存在明显的异质性。实验结果对于生命科学领域中开展人类动物模型的相关实验研究，提供MC功能和组织学参考资料。

(本文图1～6见彩插8,9,10)。

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