茵陈多糖提取工艺优化

徐红欣，管立，回鹏，陈秋玲

(河北大学 药学院，河北省药物质量分析控制重点实验室，河北 保定 071002)

茵陈为菊科植物滨蒿(ArtemisiascopariaWaldst Et Kit)或茵陈蒿(ArtemisiacapillariesThunb)的干燥地上部分.苦、辛、微寒，归脾、胃、肝、胆经，清湿热，退黄疸，常用于黄疸尿少、湿疮瘙痒、传染性黄疸型肝炎等.其含有香豆素、黄酮、色原酮、有机酸、烯炔、三萜、甾体、多糖和醛酮等多类化学成分，其多糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、半乳糖及果糖等组分[1-2].茵陈多糖具有抑菌[1,3]、护肝、调节细胞免疫平衡[4-7]、抗鼻咽癌[8]、抑制幽门螺旋杆菌对胃癌上皮细胞的粘附[9]等多方面的药理作用.目前对茵陈多糖提取工艺的研究基本上还是空白，本文利用单因素和均匀设计实验优化了茵陈多糖的提取工艺，得到的优化工艺条件为：提取温度100 ℃，提取时间80 min，提取液(mL)固(g)比50∶1,提取1次.验证实验3次，平均得率为2.25%，与预测值2.26%相比，误差仅为0.44%.

1 仪器与试剂

FA2104N型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；HH-1数显恒温水浴锅(金坛市晶玻实验仪器厂)；80-2离心机(上海荣泰生化工程有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；GZX-9070电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；DZF-6050真空干燥箱(巩义市予华仪器责任有限责任公司)；SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵(保定市新区阳光科教仪器厂)；BCD-223MT冰箱(河南新飞电器有限公司)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；移液枪(上海佳安分析仪器厂)；95%乙醇(分析纯，天津市美琳工贸有限公司)；苯酚(分析纯，天津市福晨化学试剂厂).蒸馏水(实验室自制)；茵陈(河北省安国药材市场)，经笔者鉴定为茵陈蒿ArtemisiacapillariesThunb 的干燥地上部分.

2 实验方法

2.1 茵陈多糖的提取工艺流程

将茵陈蒿在70 ℃真空干燥3 h后，粉碎，过筛，精确称取2.5 g于250 mL茄型瓶中，加入规定液固比的蒸馏水，在选择的水浴温度加热回流规定时间，过滤，将滤液真空旋转蒸发浓缩至约10 mL，加体积分数为95%乙醇30 mL，置具塞锥形瓶中，放置冰箱4 ℃过夜，然后离心弃去上清液，取沉淀，于50 ℃真空干燥，精密称重.

2.2 提取工艺最优参数的确定

在单因素实验时，依次改变提取液固比、提取温度、提取时间，以纯多糖得率为评价指标进行分析，并在此基础上确定均匀设计实验的参数，均匀设计实验方案及结果见表1.

2.3 苯酚硫酸法测定多糖含量

2.3.1 标准曲线的绘制

储备液的制备：精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.125 9 g，加蒸馏水溶解，转移至100 mL容量瓶中定容，摇匀得125.9 mg/L的储备液.

标准液的制备：分别精密量取储备液1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mL，置于25 mL的容量瓶中定容，则得5个不同浓度的标准液.

50 g/L苯酚溶液的制备：取苯酚100 g，加入铝片0.2 g，碳酸氢钠0.2 g，蒸馏，收集(180±2) ℃馏分，称取馏分1.2512 g于烧杯中，用约50 ℃的蒸馏水溶解，转移至250 mL棕色容量瓶中定容，置于冰箱中备用.

标准曲线的绘制：分别移取2 mL各浓度标准溶液于具塞试管中，快速加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混匀，再移取5 mL浓硫酸快速加入其中，盖好试管塞，充分摇匀.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室温放置5 min.以蒸馏水为空白对照，分别在490 nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以葡萄糖标准溶液c为横坐标，绘制标准曲线，得方程：A=0.014 6c+0.074，相关系数：r2=0.999 2，线性为：10.072～50.360 mg/L.

2.3.2 茵陈多糖含量的测定

精密称取实验所得粗多糖约0.010 0 g于小烧杯中，加少量蒸馏水搅拌溶解，转移至250 mL容量瓶中定容，得茵陈多糖供试品溶液.移取2 mL供试品溶液于具塞试管中，加入1 mL 50 g/L的苯酚溶液，充分混匀，再加入5 mL浓硫酸，充分混匀.沸水浴15 min，冷水浴10 min，室温放置5 min，在490 nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照.依标准曲线方程计算多糖浓度及产率.

3 结果与讨论

3.1 单因素实验结果

3.1.1 提取液固比对茵陈多糖产率的影响

采用提取温度80 ℃，提取时间2.5 h，提取1次，考察了液固比对多糖产率的影响.考察液固比依次为40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，多糖产率分别为1.56%，1.70%，1.44%，1.41%，1.39%，如图1所示.

图1表明，液固比在40∶1和50∶1之间纯多糖产率共提高8.97%，在50∶1到60∶1之间，反而大幅度下降15.29%，在60∶1与80∶1之间仍呈下降趋势，但下降趋势已不明显.判断液固比到达50∶1之后，多糖成分已基本溶出，所以液固比50∶1左右最为合适.

3.1.2 提取温度对茵陈多糖产率的影响

采用提取液固比为40∶1，提取时间2.5 h，提取1次，考察了提取温度对多糖产率的影响.考察温度为60，70，80，90，100 ℃，多糖产率分别为1.05%，1.13%，1.46%，1.61%，2.30%，如图2所示.

图1 提取液固比对茵陈多糖产率的影响 Fig.1 effect of liquid-solid ratio on Artemisia capillaris polysaccharides yield

图2 提取温度对茵陈多糖产率的影响 Fig.2 effect of extracting temperature on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由图2可以看出，随着温度的上升，纯多糖产率呈上升趋势，说明温度的提高对多糖的溶出有帮助，得出多糖的最佳提取温度为100 ℃.

3.1.3 提取时间对茵陈多糖产率的影响

采用提取温度80 ℃，提取液固比40∶1，提取1次，考察了提取时间对纯多糖产率的影响.考察时间分别为0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，多糖产率相应依次为1.57%，1.73%，1.62%，1.56%，1.50%.如图3所示.

图3 提取时间对茵陈多糖产率的影响 Fig.3 Effect of extraction time on Artemisia capillaris polysaccharides yield

由图3可以看出，提取时间超过1.5 h后多糖产率并未继续增加，反而下降；而1.5 h之前，多糖产率呈增加趋势且1.5 h时达到最高，故1.5 h左右为最佳提取时间.

3.2 均匀设计实验结果

依据之前单因素实验结果，确定了温度、液固比和时间这3个因素的取值范围：提取温度X1∶55～100 ℃；液固比X2∶30∶1～75∶1；提取时间X3∶50 ～140 min.所设计均匀设计实验方案及结果见表1.

表1 均匀设计实验方案U10(103)及结果Tab.1 Uniform design experimental program U10 (103) and results

用SPSS 19.0以纯多糖得率为因变量，以提取温度、提取液固比、提取时间为自变量进行回归分析，得回归方程如表2所示.

表2 回归方程列表Tab.2 Regression equation list

表2中，Y为纯多糖产率，X1为提取温度，X2为提取液固比(取其倍数值用于回归)，X3为提取时间.方程1为X1，X2，X3及其所有交叉作用项采用逐步回归分析所得；方程2为X1,X2,X3以进入方式回归所得.在模型汇总中，方程1调整R2=0.983，剩余标准差为0.214 17，P<0.01；方程2调整R2=0.992，剩余标准差为0.014 833，P<0.01.由调整R2值及剩余标准差可知两个方程均高度有效，方程2优于方程1,方程2的最大预测值为2.26%，综合两个方程显示的关系及前面单因素实验和均匀设计实验的结果，得出优化提取条件为提取温度100 ℃，提取液固比50∶1，提取时间80 min,提取1次。

3.3 优化提取工艺的验证

按上述工艺条件重复3次进行验证.结果纯多糖产率分别为2.20%，2.26%，2.29%，平均值为2.25%，与理论得率2.26%相比，误差仅为0.44%.

另外，在优化工艺条件下，提取3次，纯多糖得率分别为2.20%，2.36%，2.39%，平均值为2.32%，与前述提取1次平均值2.25%相比，仅提高3.11%，说明在此工艺条件下，提取1次已经比较完全，从成本计，没有必要再增加提取次数.

4 结论

以上实验得出茵陈多糖的优化提取条件为：提取温度为100 ℃，提取液固比为50∶1，提取时间为80 min， 提取次数为1次，纯多糖得率可达2.25%.

均匀设计在实验条件范围变化大而需要进行多水平实验的情况下，与正交设计相比可极大地减少实验次数，本实验结果的处理采用回归分析方法，建立了可定量描述指标和因素间关系的数学模型.验证实验的真实值与理论值十分接近，说明本实验采用均匀设计和回归分析方法得到的实验参数较为可靠，为茵陈多糖的进一步开发利用打下些许基础.

参 考 文 献:

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