环介导等温扩增技术用于消化道和呼吸道病毒检测的研究进展＊

李文桂 综述，陈雅棠 审校

（重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所 400016）

消化道病毒包括肠道病毒、肝炎病毒和急性胃肠炎病毒等，可分别引起肝炎、急性胃肠炎和手足口病等疾病，呼吸道病毒是呼吸性疾病的一种病原体。据报道90%以上急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的。在收集到的消化道和呼吸道标本中检测到相应病毒是诊断这类疾病的金标准，但通常阳性率较低，需要花费大量的物力和人力等资源；随后人们利用免疫学方法检测这些病毒刺激机体产生的循环抗原或循环抗体，尽管敏感性较高，但存在较多的假阳性；接着人们采用PCR方法检测这些病毒，敏感性和特异性有了较大的提高，但昂贵的PCR仪购置限制了它的广泛应用，研制新的病毒检测技术已迫在眉睫。

Notomi等［1］针对一段200bp左右的靶基因保守区域的6个特异序列设计4条引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）和下游外部引物（B3），利用一种具有链置换反应的DNA聚合酶和2对设计引物，对靶序列上的6个特异序列进行核酸扩增，在65℃的等温条件下反应1h即可将靶序列DNA扩增109～1010倍，产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，该技术命名为环介导等温扩增技术（loop－media－ted isothermal amplification，LAMP）。为了提高扩增效率，Nagamine等［2］设计了上游环状引物（FLP）和下游环状引物（BLP）。这对环引物可加快反应速度，在30～45min即可实现目的基因的扩增。LAMP技术具有较高的敏感性、较强的特异性，不需昂贵仪器，使用简捷、花费时间短，可目测判定结果等许多优点，可用于临床微生物的快速诊断，在各级实验室具有广阔的前景。随后LAMP检测消化道和呼吸道病毒的研究在国内外迅速开展起来，并有了许多报道，本文就这些报道展开综述。

1 消化道病毒LAMP检测

1.1 肠道病毒 人肠道病毒71型（human enterovirus 71，HEV71）和口足疫病毒（foot－and mouth disease virus，FMDV）均是常见的肠道病毒，可分别引起人的手足口病和家畜的口蹄疫。Nie等［3］针对HEV71的VP1基因设计3对引物进行RTLAMP，发现HEV71反应管为阳性，而ECHO病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管0.04TCID50；将其用于25例HEV71患者粪样的检测，发现其阳性率为100%。李坤等［4］针对HEV71的VP2基因设计2对引物进行RT－LAMP，发现HEV71反应管为阳性，而柯萨奇病毒A16型对照为阴性，其检测HEV71的敏感性为100copy／mL；将其用于41份咽拭子标本的检测，发现其阳性率为65.9%（27／41），与荧光定量PCR相当。

Dukes等［5］针对FMDV的3DRNA聚合酶基因序列设计3对引物进行RT－PCR，发现FMDV反应管为阳性，而猪水庖病毒、猪疱疹病毒、圣米格尔海狮病毒、牛杯状病毒、马鼻病毒A和牛鼻病毒等6种病毒对照均为阴性，其检测FMDV的敏感性为每管10copy，与实时荧光RT－PCR相当；将其用于98例患者标本的检测，发现其阳性率为82.7%（81／98），而RTPCR为79.6%（78／98）。秦智锋等［6］采用3D－RT－LAMP检测证实FMDV的0型和亚洲Ⅰ型反应管为阳性，而猪水庖病毒、蓝耳病病毒和猪水泡性口炎病毒对照为阴性；将其用于检测8份确诊的口蹄疫临床标本均可获得阳性结果。

1.2 肝炎病毒

1.2.1 乙型肝炎病毒（hepatitis virus B，HBV） HBV是乙型肝炎的病原体。杨劲等［7］针对HBV的S区设计3对引物进行LAMP，发现30份HBV反应管为阳性，其检测HBV的敏感性为40copy／mL。李青雅等［8］用S－LAMP检测发现20份HBV反应管为阳性，而10份鸭HBV对照为阴性。Cai等［9］针对HBV的pre－s／S区设计3对引物进行LAMP检测发现HBV反应管为阳性，而HCV对照为阴性，其检测HBV的敏感性为210copy／mL；将其用于402份HBV患者血样的检测，发现其阳性率为73.4%（295／402）。

1.2.2 甲型肝炎病毒（hepatitis virus A，HAV） HAV是甲型肝炎的病原体。Yoneyama等［10］针对HAV的5′－未翻译区序列设计3对引物进行RT－LAMP，发现HAV反应管为阳性，而脊髓灰质炎病毒、诺如病毒和HEV对照为阴性，其检测HAV的敏感性为0.6FFU／μL，而RT－PCR为0.5FFU／μL；将其用于5例HAV患者粪样的检测，发现其阳性率为100%（5／5），与 RT－PCR相当。

1.2.3 丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV） HCV是丙型肝炎的病原体。李启明等［11］针对HCV的5′－未翻译区序列设计3对引物进行RT－LAMP，发现 HCV反应管为阳性，而HIV、HBV和流感病毒对照为阴性，其检测HCV的敏感性为每管100copy；将其用于60份HCV患者血样的检测，发现其阳性率为98%（59／60），而 RT－PCR为100%（60／60）。

1.2.4 小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV） MHV是小鼠肝炎的病原体。袁文等［12］针对 MHV的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）编码基因设计3对引物进行LAMP，发现MHV反应管为阳性，而小鼠脑脊髓炎病毒、汉坦病毒和犬冠状病毒对照为阴性，其检测MHV的敏感性为0.1 pg基因组DNA／μL，比RT－PCR灵敏10倍；将其用于55份临床样本的检测，发现其阳性率为27.3%（15／55），而 RT－PCR为12.7%（7／55）。

1.3 诺如病毒 诺如病毒是一种杯状病毒，是急性病毒性胃肠炎的常见病原体。Fukuda等［13］针对该病毒的RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白编码基因之间的保守区域设计3对引物进行RT－LAMP，发现诺如病毒反应管为阳性，而星形病毒、腺病毒和轮状病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管102～103copy；将其用于75例患者的粪样检测，发现其阳性率为100%（75／75），而 RT－PCR为94.7%（71／75）。

宋克云等［14］针对该病毒的RNA聚合酶基因设计2对引物进行RT－LAMP，发现48份诺如病毒GⅡ型反应管为阳性，而12份轮状病毒A对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为15.6pg基因组DNA／管，与RT－PCR相当；将其用于48份患者的粪样检测，发现其阳性率为95.8%（46／48），与 RT－PCR检测结果一致。

罗剑鸣等［15］针对该病毒的RNA依赖的RNA聚合酶和衣壳蛋白编码基因区域设计3对引物进行RT－LAMP，发现诺如病毒GⅡ型反应管为阳性，而轮状病毒、星状病毒和诺如病毒GⅠ型对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管1000 copy，与RT－PCR相当；将其用于93份腹泻患者的粪样检测，发现其阳性率为36.6%（34／93），而 RT－PCR为38.7%（36／93）。

Yoda等［16］针对该病毒的衣壳蛋白编码基因的N末端区域设计3对引物进行RT－LAMP，发现诺如病毒GⅠ型和GⅡ型反应管均为阳性，而轮状病毒A和轮状病毒C对照均为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管80～200copy；将其用于88例腹泻患者的粪样检测，发现其阳性率为81.8%（72／88），而RT－PCR为48.9%（43／88）。Fukuda等［17］用基于核苷酸序列扩增的RT－LAMP检测14个牡蛎样品，发现诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的阳性率分别为为64.3%（9／14）和78.6%（11／14）。Iturriza等［18］用RT－LAMP试剂盒检测510份腹泻患者的粪样，发现其阳性率为68.8%（350／510），而 RT－PCR为70.8%（361／510）。

2 呼吸道病毒LAMP检测

2.1 流感病毒A 流感病毒A是甲型流感的病原体。Poon等［19］针对该病毒的 M基因设计2对引物进行RT－LAMP，发现22株流感病毒A反应管为阳性，而11株其他流感病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管10－3PFU，而PCR为每管10－2PFU；将其用于47例鼻咽分泌物标本的检测，发现其阳性率为46.8%（22／47）。

Ito等［20］针对该病毒的血凝素 A（hemagglutinin A，HA）编码基因设计2对引物进行RT－LAMP，发现AH1株和AH3株反应管为阳性，其检测该病毒的敏感性为10FFU／mL；将其用于83份鼻咽分泌物的检测，发现其阳性率为85.9%（71／83），而病毒分离为94%（78／83）。

Kubo等［21］同样针对该病毒的HA编码基因设计3对引物进行RT－LAMP，发现333株H1N12009流行株反应管为阳性，而H3N2株对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管10copy；将其用于260个鼻咽拭子的检测，发现其阳性率为52.3%（136／260），而RT－PCR为53.5%（139／260）。Ma等［22］用HA－RT－LAMP检测发现26例H1N1株反应管为阳性，而24例其他流感病毒株对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管40copy。聂凯等［23］用 HA－RT－LAMP检测证实美国甲型H1N1流感样品反应管为阳性，而其他流感病毒株对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管60copy；将其用于30份人甲型H1N1流感患者的样本检测，发现其阳性率为90%（27／30），而 RT－PCR为83.3%（25／30）。张永乐等［24］用 HART－LAMP检测发现36例甲型H1N1流感咽拭子样品为阳性；其检测该病毒的敏感性为每管103copy，比RT－PCR敏感10倍。

2.2 禽流感病毒A 禽流感病毒A是禽流感的病原体。李启明等［25］针对该病毒的HA编码基因或神经氨酸酶A（neuraminidase，NA）编码基因分别设计3对引物进行RT－LAMP，发现禽流感病毒A H5N1株反应管为阳性，其检测该病毒的敏感性为每管10copy；将其用于51份患者的样品检测，发现其阳性率为70.6%（36／51），与实时PCR相一致。

2.3 SARS冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS－Cov） SARS－Cov是 SARS的病原体。Thai等［26］针对该病毒的0RF1b基因设计3对引物进行 RTLAMP，发现SARS－Cov反应管为阳性，其检测该病毒的敏感性为每管0.01PFU，而RT－PCR为每管1PFU；将其用于59个鼻咽拭子的检测，发现其阳性率为22.0%（13／59），而RTPCR为10.0%（6／59）。Poon等［27］同样针对该病毒的0RF1b基因设计3对引物进行RT－LAMP，发现SARS－Cov反应管为阳性，而呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A和B对照均为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管10copy；将其用于31例鼻咽拭子的检测，发现其阳性率为64.5%（20／31）。

2.4 人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV） HRSV是儿童呼吸道感染的主要病原体。Ushio等［28］针对该病毒的核壳蛋白编码基因设计3对引物进行RTLAMP，发现HRSV反应管为阳性，而流感病毒A和B、麻疹病毒以及腮腺炎病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为0.06TCID50；将其用于50份鼻咽拭子的检测，发现其阳性率为94%（47／50），而病毒分离和 RT－PCR 为58%（29／50）和84%（42／50）。Shirato等［29］同样针对该病毒的核壳蛋白基因设计3对引物进行RT－LAMP，发现HRSV反应管为阳性，而冠状病毒、流感病毒和腺病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管0.01～0.10PFU；将其用于59例鼻咽拭子的检测，发现其阳性率为61%（36／59），而病毒分离和RT－PCR为34%（20／59）和68%（34／59）。

2.5 麻疹病毒 麻疹病毒是麻疹的病原体。Fujino等［30］针对该病毒的核蛋白的编码基因设计3对引物进行LAMP，发现麻疹病毒反应管为阳性，其检测该病毒的敏感性为0.04 TCID50，而RT－PCR为0.4TCID50；将其用于50例冻存4年的标本和11个新鲜标本的检测，发现其阳性率分别为98%（49／50）和81.8%（9／11），而 RT－PCR分别为88%（44／50）和72.7%（8／11）。

2.6 腮腺炎病毒 腮腺炎病毒是流行性腮腺炎的病原体。Okafuji等［31］针对该病毒的血凝素－神经氨酸酶（hemagglutinin－neuraminidase，HN）编码基因设计3对引物进行LAMP，发现腮腺炎病毒反应管为阳性，其检测该病毒的敏感性为0.024PFU／μL，与RT－PCR相当；将其用于75个唾液拭子的检测，发现其阳性率为64.0%（48／75），而 RT－PCR为62.7%（47／75）。

2.7 风疹病毒 风疹病毒是风疹的病原体。Mori等［32］针对该病毒的E1基因设计3对引物进行RT－LAMP，发现风疹病毒反应管为阳性，而麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为30PFU／mL；将其用于9例患者的标本检测，发现其阳性率为77.8%（7／9），而病毒分离和 RT－PCR为33.3%（3／9）和66.7%（6／9）。

2.8 新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV） NDV是鸡瘟病的病原体。Pham等［33］针对该病毒的融合基因设计2对引物进行RT－LAMP，发现38株NDV反应管为阳性，而鸡痘病毒和禽呼肠孤病毒对照为阴性，其检测该病毒的敏感性为每管0.5pg，与巢式PCR相当；将其用于感染NDV 3d的鸡肺气管组织的检测，发现其阳性率为75%（6／8），而感染6d标本的阳性率为100%。

2.9 结膜炎腺病毒 结膜炎腺病毒是眼科感染的常见病原体。Wakabayashi等［34］针对该病毒的Ad1亚型、ad3亚型和Ad4亚型的第6区基因以及ad8亚型、ad19亚型和ad37亚型的纤维区基因分别设计2对引物进行LAMP，发现这些亚型反应管均为阳性，其检测该病毒的敏感性为每管103～104copy；将其用于13份临床样本的检测，发现其阳性率为84.6%（11／13），而PCR为100%（13／13）。

3 展 望

将LAMP技术用于消化道和呼吸道病毒的检测具有许多好处。因为LAMP技术针对保守靶序列的6个特定片段设计2～3对相关引物进行核酸扩增，所以核酸扩增具有较强的特异性；在LAMP刚开始反应时，以6n倍量进行核酸扩增，在1h内就能扩增出109～1010copy的靶序列基因，所以灵敏度较高，其灵敏度可与实时定量PCR相当，比传统的PCR技术的灵敏度提高2～3个数量级；因为LAMP反应可生成肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，所以用目测即可鉴定结果；因为LAMP反应在等温条件下进行，不需要变温条件，所以不需要昂贵的PCR设备，操作步骤非常简单，应用方便，所以在基层应用具有较广阔的前景。

当然LAMP技术也有一些不可避免的缺点。因为LAMP引物设计需专门软件，需设计引物2～3对，设计程序繁琐，所以引物筛选工作将花费大量的时间和精力；因为LAMP引物之间可能存在互补结构而出现非特异条带的扩增，所以出现假阳性的概率较多；LAMP反应扩增的靶序列基因长度通常不超过300bp，与非特异扩增的产物不宜鉴别；LAMP扩增的靶基因序列通常较短，所以不能进行基因的克隆、测序和表达；当进行常规LAMP反应完毕后，打开反应管时可造成气溶胶污染；LAMP技术很难扩增长度大于500bp的靶基因，所以不能进行长链DNA扩增。随着时间的推移，LAMP技术将不断得到完善，在不远的将来极有可能用于消化道和呼吸道病毒的临床检测。

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