高致病性禽流感实验室检测风险的分析及预防

章春燕 （辽宁省朝阳市动物疫病预防控制中心 122000）

高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）是由正粘病毒科A型流感病毒属流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。高致病性禽流感因其在禽类中传播快、危害大、病死率高，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。近年在家禽身上分离出了H7N9亚型高致病性禽流感病毒，各地兽医实验室加强了高致病性禽流感的血清学及病原学检测工作。我市的兽医实验室是生物安全Ⅱ级，承担起了辖区内H7亚型高致病性禽流感的感染抗体检测工作，以及高致病性禽流感的病原学检测工作。对于从事检测工作的兽医实验室人员，做好自身防护，不被感染，使得兽医实验室生物安全显得尤为突出。有效的防护不仅体现在对实验室生物安全高度重视，还体现在操作人员对自身的科学防护措施上，笔者将这些经验和知识总结出来，以避免在进行高致病性禽流感抗体和病毒核酸检测时，样本中有害或潜在危害的生物因子对人、环境造成危害或潜在危害。

1 安全级别及检验活动的要求

实验室的生物安全防护水平的分级是根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施而划分。对于生物安全Ⅱ级兽医实验，我们要按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全认可准则》等相关要求，从事高致病性禽流感血清学及未经培养核酸检测工作，在做核酸检测工作时，所有样本操作要求在生物安全柜内进行。严格执行生物安全Ⅱ级兽医实验室对高致病性病原微生物的要求，不进行高致病性禽流感病毒的分离培养等超出实验室安全等级的实验操作活动。

2 风险分析和预防措施

高致病性禽流感在生物安全Ⅱ级兽医实验室的检测项目主要有血凝和血凝抑制试验，病毒核酸检测。围绕这两项检测活动所涉及的感染风险，主要体现在个人防护以及试验操作过程中样本与人、样本与环境、以及样本间的污染风险。

2.1 个人防护

生物安全实验室的核心是安全，最重要的体现是检测人员自身的安全。高致病性禽流感是主要是经呼吸道感染，在实验操作中，可能出现含病毒的液体飞溅或形成气溶胶，因此检验人员检测时应穿专用的工作服或防护服，戴防护较好的手套、口罩、帽子及眼镜，条件好的实验室可佩戴防化学飞溅面罩。实验结束后，手套、鞋套、帽子、口罩等一次性防护用品要摘掉放入垃圾袋中待集中高压灭菌处理，工作服可在紫外灯下进行消毒。实验室内长期备有75%的酒精、急救箱等急救设施，并定期检查是否在保存期内。

2.2 样本的接收、处理和储存

样本在接收或转运时，可能存在密封或包装不严，液体撒漏，或者样品中夹杂禽类的羽毛，造成空气中有含病毒的粉尘，从而导致感染性材料等危险因子进入实验室。样本在接收或转运时，严格的执行实验室生物安全标准操作规程，在生物安全Ⅱ级实验室固定的接样室接收样本，然后通过专门的传递窗转运样本至样品保存室，传递窗要定期进行紫外杀菌消毒。制备样本时，在生物安全柜内操作。检测样品做好详细记录，放入4℃冰箱保存，用以留样的样本确保容器盖拧紧放入零下20℃以下的冰箱保存。操作结束后，用有效氯含量为200～400毫克/升的含氯消毒剂消毒地面、台面。

2.3 血凝和血凝抑制试验

如果血清样本中有高致病性禽流感病毒阳性样本，在检测中由于操作不当，引起血清外溢，或者使用移液器不当产生气溶胶造成操作台面、器械及环境污染。试验操作中稀释血清样本时，移液器操作要力度适当，尽量避免产生气溶胶。盛装血清的离心管试验结束后要确认管盖紧密闭合。试验结束后，需用消毒液擦拭台面、地面，将移液器放置在紫外灯下照射30分钟，96孔U型反应板、试验耗材等试验废弃物装入黄色垃圾袋密封高压灭菌30分钟，方可带出实验室处理。

2.4 核酸检测

本实验室为荧光PCR检测仪，核酸检测的试验步骤包括核酸提取，PCR反应体系的配置、PCR运行、结果分析等过程。操作人员除严格的执行PCR实验室分区的操作规定外，也要执行工作服分区，在不同的实验区穿该区特定的工作服，避免各工作区间的交叉污染。

核酸提取。棉拭子样品检测前应漩涡震荡2～3分钟，漩涡震荡的过程中有可能管盖松动引起液体渗出或泄露，造成环境及样本间的污染。组织样本在试验前需研磨，手动研磨组织样品时有可能用力过大使组织喷溅到外部造成污染。病毒裂解时，将离心管（EP）内的裂解液与样本液颠倒混匀时，可能使管盖粘上病毒核酸，在开盖进行下一步操作时使病毒核酸污染手套。移液器操作不当造成溶液滴漏或气溶胶，高速冷冻离心机没有配平或离心机内安全罩没有盖紧，可能会产生气溶胶，严重的可能使EP管碎裂，造成仪器设备的污染和损坏。棉拭子在漩涡震荡前应确认管盖密闭。研磨组织样本在生物安全柜中进行试验操作，在打开EP管时要双手开管，减少手套与样本的接触范围。要使用质量好的EP管以防止管盖密闭不严或操作不当等因素导致的感染性液体外溢和污染试验设备。若发生管盖不严或操作不当引起样品泄露污染试验设备，应及时用消毒液喷洒或擦拭生物安全柜台面，移液器、仪器设备以及管外壁等污染的物体表面。使用高速冷冻离心机时，要在离心前保证配平离心管，盖紧安全罩后启动离心机。

PCR体系的配制。在该操作过程中可能因为阳性样品操作不当引起洒溢，或者加入阳性核酸样品时因为移液器操作不当形成气溶胶导致整个实验室环境被污染，并会影响以后实验结果出现假阳性结果。若因各种操作不当因素导致样本核酸的洒溢，要及时用含氯制剂的消毒液喷洒或擦拭并用紫外灯照射生物安全柜台面、实验室地面等被污染物体表面。

PCR运行。PCR管密闭不严或质量不好是PCR管内样本液体泄露，造成PCR仪的污染，选用质量上乘的PCR管，上机前确保PCR管密闭严实。

PCR实验废弃物处理及实验室终末消毒。实验活动结束后，相关的实验废弃物必须严格按照实验室生物安全操作规范集中处理。实验室内的仪器设备可使用喷雾消毒剂消毒，消毒剂可选用有效氯为200～400毫克/升的含氯消毒剂溶液消毒。地面消毒先从外向内喷洒一次，喷洒药量为200～300毫升/平米，待室内消毒完毕后，在从内向外重复喷洒一次。实验室在实验间歇，可用甲醛熏蒸法彻底消毒。

3 结语

高效病性禽流感疫情形势不容乐观，兽医工作者应当加强生物安全学习，做好实验操作风险分析，通过预防措施将风险降到最低。