猪嵴病毒的特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，姚春阳，王 艳，李 峰，沈志强

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪 嵴 病 毒（Porcine kobuvirus，PKV）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）嵴病毒属（Kobuvirus） 成员[1]，是一种新发现的无囊膜的单股正链RNA病毒，可引起仔猪的病毒性腹泻。自2010年底以来，我国大部分省份规模化猪场相继发生了以乳猪高发病率、高死亡率、药物防治效果差、现有疫苗免疫效果多不明显为特征的猪病毒性腹泻疫情[2]。其主要症状为哺乳仔猪多在出生2～3 d后先呕吐，后腹泻，体质量下降及严重脱水，迅速死亡，母猪和育肥猪无明显症状[3]。据报道，在这次疫情中检测到病毒主要包括猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diamhea virus，PEDV）、 猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PRoV）、沙波病毒（Sapovirus）、猪博卡病毒（Porcine Boca virus，PBoV）和PKV。虽然研究发现PEDV在此次腹泻疫情中占主要地位，但应用猪流行性腹泻和传染性胃肠炎二联疫苗等常规腹泻疫苗强化免疫效果并不明显，而且乳猪腹泻循环反复发生。此次腹泻疫情持续时间长，不仅造成了仔猪成活率降低，感染2周内仔猪发病率高达100%，死亡率在80%以上，5日龄内的仔猪死亡率更是达到100%，而且造成饲料转化率降低、日增重低等后果，给养猪业造成了极大的危害和严重的经济损失[4]。PKV是否与当前的疫情有关，尚无定论。但由于PKV阳性检出率相对较高，专家分析可能与其他肠道病毒如PEDV、TGEV和PRoV发生混合感染或成为疾病发生的诱导因素，甚至有可能对动物乃至人类健康造成潜在的威胁[5]。因此，及时加强对PKV的研究具有重要的现实意义。本文对PKV的由来和发现、病毒的分类地位、基因组结构、蛋白质、流行病学及检测方法等研究现状做一简要概述，为科研人员对PKV的研究及了解仔猪病毒性腹泻疫情的整体概况提供参考。

1 病毒的由来和发现

2007年匈牙利科学家Reuter等[6]根据用于扩增杯状病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因所设计的通用引物，在利用RT-PCR方法检测10日龄以下仔猪腹泻粪便样品中否存在猪杯状病毒属（Porcine calicivirus）的诺如病毒（Norovirus）和沙波病毒时扩增出一条非特异性条带，序列分析发现与爱知病毒有一定的同源性，系统发育分析显示属于嵴病毒属成员，这是首次在猪粪便中检测到PKV，我国也于同期分离到了该病毒，这2株分离毒株分别被命名S-1-HUN 和 swine/2007/CHN[7]， 而且这2株毒株也被认可为PKV的参考毒株，从此揭开了PKV研究的序幕。此后，PKV在匈牙利、泰国、日本、韩国、巴西和荷兰等国家相继被报道，阳性检出率很高，并且发现在具有腹泻症状的猪群中，阳性率明显高于无腹泻症状的猪群[8]。目前关于PKV的研究相对较少，PKV与人和动物各种疾病的关系还有待进一步研究。

2 病毒的分类地位

根据国际病毒分类委员会（ICTV）2013年2月份最新的病毒分类报告，目前小RNA病毒科已包含17个属，嵴病毒属包含的3种病毒分别进行了重新命名，即人爱知病毒（Aichi virus，AiV）正式更名为爱知病毒A（Aichivirus A），牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKV）更名为爱知病毒B（Aichivirus B），作为原来的一个候选种，PKV被正式确定为一个新种，被命名为爱知病毒C（Aichivirus C）[9]。目前为止，嵴病毒属已经公认的只有这3个种。

3 病毒的流行病学特点

PKV目前在世界范围内广泛流行，在腹泻和健康乳猪群、断乳仔猪群、肥育猪群、母猪群的粪便或血清样品中阳性检出率均很高，在具有腹泻症状的乳猪群中尤甚，而且在这些发病乳猪中其他常见腹泻病毒如TGEV、PEDV和PRoV的检出率并不高。尽管如此，PKV是否与猪的肠道疾病相关，目前尚无定论。病毒通过何种途径传播，目前也没有确切的证据证明。有专家认为病毒可能从胃肠道系统转入了血液循环系统，从而导致病毒血症，粪-口途径也可能是PKV的传播途径之一。另外，也可能存在其他传播途径，如哺乳、血液及食物等[10]。

4 病毒检测技术研究进展

4.1 病毒的分离培养

嵴病毒属人AiV能在BS-C-1和Vero细胞上增殖并产生明显的细胞病变，但不能引起人体细胞如人宫颈癌细胞（HeLa细胞）、人胚肺细胞（HEL细胞）、人恶性胚胎横 肌瘤细胞（RD细胞）及乳鼠细胞病变[11]。BKV能在Hela细胞上增殖并且引起病变[12]。而PKV目前尚未找到合适的培养细胞，体外培养尚未成功[13]。

4.2 血清学检测技术

日本学者用抗AiV单克隆抗体建立的ELISA检测方法，用于检测粪便中AiV，结果表明此方法比病毒分离更敏感，比病毒中和试验更简便快捷，但迄今并没有商业化的试剂盒[14]。Yamashita 等通过电镜和SDS-PAGE等方法获得了纯化的BKV病毒粒子蛋白并制备抗血清，建立了一种可检测BKV的ELISA检测方法。国内学者陈蕾等[15]（2012）对PKV的主要结构蛋白即中和抗体结合蛋白VP1蛋白进行了表达，并对其主要的抗原表位、二级及三级结构进行分析。该结果为PKV特异性抗原的免疫印迹和ELISA等血清学方法的建立提供了科学的参考依据，有助于进一步推进PKV的研究。

4.3 分子生物学检测技术

4.3.1 PCR技术

目 前，Reuter等[16]（2009） 根 据猪嵴病毒属3种嵴病毒AiV、BKV和PKV的最保守区域（3D区域）设计引物，能成功地检测到上述3种病毒，这为嵴病毒分子流行病学的调查及宿主物种的检测提供了可能。Khamrin等[13]（2010）于2009年从日本28个猪场的健康猪群采集了293头份粪便样品进行RT-PCR检测，结果检出PKV阳性率为45.4%（133/293）。我国自2009年首次检测到PKV以来，目前多个省市自治区均有检测到该病毒的报到。胡军勇等[17]（2012）根据PKV的3D基因建立RTPCR方法，并用此法对在湖北省各大猪场采集的165头份病料进行检测，结果检测出阳性样品118份，在具有腹泻症状的猪群中PKV的阳性率高达82.5%，而在非腹泻猪群中PKV的阳性率只有13.23%，并且研究还发现PKV在仔猪中的阳性率要高于育肥猪和种猪中的阳性率。王长松等（2012）于2010年从位于上海市闵行区、青浦区和奉贤区的3个规模猪场采集了116头份猪粪便样品，经RT-PCR检测，共检出PKV阳性样本15份，阳性率为38.8%，3个规模猪场的阳性率分别为46.7%、35.1%和32.4%，说明上海猪群中PKV感染率较高。张莎等（2013）于2012年利用RT-PCR方法对我国24个省市84个猪场的236头份病料样品进行PKV检测。结果共检出PKV阳性样本63份，阳性率为36.69%；而在检测的84个猪场中，共有36个猪场显示PKV阳性，猪场阳性率为42.85%，除了我国西北地区未检测到PKV之外，其他地区均检测到了PKV，并且该病毒在华中和华东地区流行最为严重。张文波等[18]（2013）根据PKV的3D基因设计引物建立RTPCR检测方法，其最小检测量可达2.3 pg。对江西省2010年冬至2012年2月收集的100份仔猪PEDV阳性样品进行PKV检测，阳性率达42.86%。李淞等[19]（2013）根据PKV的3D基因设计引物建立的RT-PCR方法，最低可以检出1 pg的病毒核酸，而且该方法在病毒含量较低的情况下，也能准确检测出病毒核酸，具有较高的敏感性，能够有效地对早期感染猪群进行诊断和监控。高敏感性和特异性引物的设计成功，为嵴病毒分子流行病学调查提供了可靠的技术支持，敏感性也大大高于ELISA。

4.3.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR同普通PCR相比，具有更高的敏感性，能高效、准确、快速地检测出PKV。修金生等（2012）根据PKV的3D蛋白序列基因设计引物，建立了检测PKV的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法。该方法可实时定量分析病毒核酸在动物体内的含量来明确其PKV感染水平和确定感染靶器官，同时为PKV的早期诊断提供重要参考。刘孟良等（2013）也建立了检测PKV的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法，其最低检出拷贝数为100拷贝，且具有良好的稳定性和较高的精确度。

5 展望

PKV是一种新发现的病毒，它不仅具有传染性而且在世界范围内广泛分布，给世界猪业带来危害的同时也给科研人员带来了挑战和机遇。目前关于PKV的研究才刚刚起步，其细胞感染机制、流行病学特征、病毒感染的病理生理学及免疫学等方面的研究较少，相关报道也比较匮乏。尽管普遍认为PKV可能感染猪的胃肠道，但在发生或没有腹泻病症的猪粪便或血清样品中均能检测到PKV。这说明PKV可能是条件性常在病毒，感染率高并不能确定其是否与仔猪腹泻相关，仍需要病毒分离与动物回归试验证实其与仔猪腹泻的关系，也可能是因为PKV与其他肠道病毒的混合感染成为疾病发生的诱因。因此，对嵴病毒的结构和功能、发病机制、传播机制、致病性、临床表现、免疫应答和基因遗传演化等方面的深入研究将成为未来嵴病毒研究的重点，只有这样才能有助于对PKV的真正认识和有效防控。相信随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，人们对嵴病毒的认识会越来越深刻，将会得到更多仔猪病毒性腹泻的相关知识，对于规模性猪场防控仔猪腹泻提供更全面及时的信息和更多有用的方法和技术。

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