苦瓜降血糖活性成分提取与评价方法研究进展

于 斌 葛邦国 和法涛 吴茂玉* 刘光鹏

（1.枣庄学院生命科学学院，山东枣庄277160；

2.中华全国供销总社济南果品研究院，山东济南250014）

1 苦瓜降血糖活性成分提取方法

1.1 皂苷的提取

1.1.1 传统浸提法

水和乙醇常作为天然产物的浸提剂，在提取分离植物活性成分方面多有报道[1,2]。将鲜苦瓜切碎、晾干、粉碎成苦瓜粉，乙醇回流浸提即可得到皂苷提取液，为进一步分离皂苷可以将乙醇回收，然后用石油醚、正丁醇萃取，再经甲醇、丙酮除杂后，即得苦瓜粗皂苷样品[3]。乙醇溶液浸提苦瓜皂苷已被很多研究人员所采用[4，5]，这种方法直接从苦瓜中提取皂苷，使用了较多的有机溶剂，程序较为复杂。苦瓜皂苷也可在苦瓜活性物质的综合利用中提取。以水作为溶剂，在一定温度下，将苦瓜粉加热、回流，使有效物质得到充分浸提，再用乙醇沉淀多糖类物质，过滤分离，沉淀和滤液经精制、纯化后分别为苦瓜多糖和苦瓜皂苷[6]，这种方法可有效利用原料、提高产出和效率，具有进一步推广的价值。

1.1.2 超声/微波辅助提取法

在众多的提取技术中，超声波辅助提取作为一种辅助提取技术应用较为广泛。苦瓜细胞在超声波产生的强烈振动度以及强烈的空化效应下被破坏，有利于有机溶剂在其细胞中的渗透，从而提高苦瓜皂苷的提取率。李健等[1]选择超声时间、超声温度和超声功率为试验因素，以总皂苷提取量为考察指标，通过单因素和正交试验对超声波辅助提取苦瓜皂苷的工艺条件进行了优化，其所得结果为超声时间40min、超声温度50℃、超声功率450W。陈志强等[7]利用响应面法对超声提取苦瓜皂苷的工艺条件进行了优化，他发现，最佳工艺条件为：超声时间41min，超声温度62℃，超声功率402W。两种提取条件差异不大，可见超声辅助提取可以有效的推广。

随着近年来提取工艺的不断进步和创新，微波辅助提取技术成为最为广泛应用的提取技术之一。该技术是通过微波辐射使苦瓜植物细胞内的极性物质（主要是水分子）吸收微波能，从而产生较多热量，迅速提高苦瓜植物细胞内的温度。细胞内的液态水在较高温度下被气化，较高的压力将细胞膜和细胞壁冲破，再继续加热，使得细胞内部和细胞壁进一步失水，细胞收缩，表面出现裂纹，便于有机溶剂渗透入苦瓜细胞，使其更容易地从中提取出苦瓜皂苷，从而大大提高了苦瓜皂苷的浸提效率。高文等[8]应用微波辅助技术提取苦瓜皂苷，得到的微波提取最佳工艺参数为微波功率750W，提取时间10min。实验结果表明，微波提取法能够大大提高苦瓜植物细胞中苦瓜皂苷的提取率。李健[9]通过试验也得出了类似的结论。将微波提取技术作为一种辅助手段在苦瓜皂苷的提取中进行应用，不但能够提高浸提效率，而且还能够减少投资、节省时间、节省能源、减少环境污染等。因此，在现在的提取工艺中，常将微波与有机溶剂相结合应用，可以有效地提高苦瓜皂苷的提取效率。

1.1.3 酶提取法

酶法在植物活性成分提取方面应用较多，植物中含有纤维素及淀粉，将活性成分包裹起来，这对活性成分的释出产生很大的干扰作用，用酶降解纤维素及淀粉有利于活性成分的释出。复合酶法、纤维素酶法、淀粉酶法、糖化酶法都可以用于植物活性成分的提取[10]。这类方法是将未成熟的新鲜苦瓜，洗净去籽并制成匀浆，然后加入适量的蒸馏水进行稀释，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调pH值，加入酶适量，于恒温水浴锅中加热，使活性物质充分浸提[11]。酶提取法选用酶液（一般是果胶酶和纤维素酶为主体的复合酶）来分解构成细胞壁和细胞质间的果胶质、纤维素和半纤维素，使其疏松、膨胀、崩溃，从而增大了有效成分的扩散面积，减小了传质阻力，提高了有效成分的得率。影响因素有加酶量、料水比、提取温度、pH值等。酶解提取条件温和，减少了活性物质的损失和溶剂消耗。

1.1.4 超临界提取法

超临界提取是在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来。张中伟[12]利用超临界CO2提取苦瓜总皂苷，他发现该法的最佳工艺条件为萃取压力25.5MPa、温度42.5℃、夹带剂用量180mL。超临界CO2法具有工艺简单、萃取溶剂无毒、能耗低、易回收、所得产品具有纯度高的优点，弥补了传统工艺温度高、受热时间长而使某些皂苷含量降低甚至损失殆尽的缺陷。然而该法生产成本高、所需设备复杂、不易清洗和修理，所以其推广应用范围仍然受到一定制约。

1.1.5 其他潜在提取方法

除了以上提及的苦瓜皂苷提取方法，还有一些用于其他种类皂苷的提取方法也可用于苦瓜皂苷的提取。半仿生提取法即模拟口服给药及药物经胃肠逆转运的原理，将原料先用一定pH值的酸性水提取，再以一定pH值的碱水提取，提取液分别过滤、浓缩，制成相关产品。宋宏新等[13]采用半仿生-α-淀粉酶酶解提取三七皂苷，相对乙醇回流法、酶解法、发现半仿生-α-淀粉酶酶解提取三七皂苷的方法经济有效，但还未见用在苦瓜皂苷的提取中。

1.2 苦瓜黄酮的提取工艺

1.2.1 传统浸提法

利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂萃取，可达到精制纯化的目的。这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产。甲醇、乙醇和丙酮是最常用的黄酮类化合物提取溶剂，但由于甲醇、丙酮等有毒，因此一般采取乙醇为提取剂。郭育东等[14]以乙醇为溶剂回流提取苦瓜总黄酮，研究表明在乙醇浓度80%，提取时间2h，提取温度70℃，料液比1:12的条件下总黄酮的提取率最高，可达1.51%。李淑玲[15]选取非离子型表面活性剂用于协同提取苦瓜中的总黄酮，她发现Tween-80对苦瓜中总黄酮的提取具有较好的协同作用，且居各影响因素首位。这主要是由于表面活性剂改变了苦瓜粉的表面张力，从而使得其更易于被浸润，使得黄酮成分有效提出。

1.2.2 超临界萃取法

由于超临界CO2萃取技术具有操作条件温和、分离容易、提取速度快、提取物纯度高、活性成分和热敏成分不易被破坏等优点，己成功地应用于多种天然产物有效成分的提取[16，17]。谢建华[18]利用利用响应面法优化超临界CO2萃取苦瓜总黄酮的工艺参数，采用无水乙醇为夹带剂（4mL/g），萃取压力33.14MPa、萃取温度46℃、萃取时间53.2min。此条件下，苦瓜总黄酮提取率达到84.13%，且具有很好的抗氧化性。超临界技术还用于苦瓜叶中黄酮的提取，具体提取条件如下：以用量为1:1（V:m）的95%乙醇浸润1h，夹带剂体积与原料质量比2:1，CO2流量22L/h、萃取压力28MPa、萃取温度44℃，萃取时间150min[19]。二者萃取条件的差异可能由原料不同所致。

1.2.3 超声波/微波辅助提取法

微波提取技术因其有提取时间短、溶剂用量少及提取效率高等优点受到关注。李星彩[20]在萃取苦瓜中黄酮类化合物的过程中利用功率400W微波辅助萃取苦瓜黄酮，该方法萃取时间短、成本低、产品易分离。类似的方法也被用于苦瓜叶中黄酮类物质的提取，李宪平[21]研究苦瓜叶的微波法提取总黄酮，仅微波照射2.5min就能显著提高黄酮的提取率。李广利[22]比较了乙醇提取和微波提取苦瓜叶中黄酮的工艺差别，乙醇提取时间4h，而微波提取时间仅为3min，从时间及成本等方面考虑微波法值得推广采用。不同微波萃取条件不同，这主要与所采用的设备、有机溶剂使用浓度等因素有关。

近年来，超声技术已应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质等研究。其原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。郭青枝[23]研究苦瓜黄酮的超声波提取工艺，最佳条件为超声波功率80W，提取时间20min，提取液为体积分数90%的乙醇溶液，料液比1:30(g:mL)。并与传统提取法进行了比较，结果表明，超声波提取苦瓜黄酮优于传统提取法，具有省时、高效的优点。其他关于苦瓜黄酮的超声波提取研究较少，可以借鉴大豆异黄酮[24]、银杏叶黄酮[25]的提取方法。

1.2.4 其他潜在方法

由于黄酮苷类物质易溶于水，所以对黄酮苷类物质含量较高的原料，可以采取热水提取法。在提取过程中要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素[26]。此工艺成本低、安全，适合工业化大生产，但由于水具有较大极性，易把糖类、蛋白质等溶于水的成分提取出来，给进一步分离带来许多麻烦。但是因为消耗溶剂的成本比其他浸提方法低，设备简单，仍为一种可取的浸提方法。2-苯基色原酮作为黄酮类物质（多羟基化合物）的母核，当其在碱性条件下，苯基色原酮1、2碳之间的C-O键打开成查耳酮型结构，此物能够溶于水；当在酸性条件下时，查耳酮即可恢复原来的闭环结构，所以可用碱水提取。碱液提取时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。常用的碱性溶液是NaOH、Ca(OH)2水溶液。碱性水中的NaOH浸出能力较高，但是杂质较多，不利于纯化；石灰水有利于纯化但浸出效果不如氢氧化钠好。这些方法都可以用于苦瓜黄酮的提取，但由于提取物中成分较为复杂，因此要根据实验目的综合考虑[27,28]。

1.3 苦瓜多糖的提取

1.3.1 传统浸提法

苦瓜多糖的传统做法是溶剂浸提法，因其操作简单，成本低廉，受到广泛的采用。其关键流程多糖的水提醇沉，该法利用多糖溶于水不溶于体积分数60%以上乙醇的性质，先用热水浸提苦瓜中的多糖，经浓缩后用60%（v/v）乙醇沉淀得多糖。关于苦瓜多糖浸提的研究报道基本上是围绕着温度、时间、pH值和料液比等因素进行条件优化。黄婧等[29]建立了提取苦瓜多糖的的数学模型，确定了最优提取条件。她认为影响苦瓜粗多糖提取率的因素大小的顺序为温度、pH值、水料比和提取时间。刘金福等[30]进行了类似的研究，发现料水比1:20，浸提温度100℃，浸提时间1h时提取率较高。

综合各种文献的情况，提取过程中还需注意的是原料的预处理形式与方法，这对于苦瓜多糖的提取也是较为重要的，应在进一步的研究中予以考虑。

1.3.2 超声波与微波辅助提取法

超声波的振动能与微波的加热能也可用于提取大分子物质。李宏睿[31]与单斌[32]分别采用正交实验设计和响应面法实验设计优化了超声波辅助提取苦瓜多糖，二者提取时间差异较大，这可能与采用的处理温度有关，一般温度较高时间较短，另外所采用的仪器也可能是导致差异的原因之一。相对于超声波提取方法，微波提取苦瓜多糖的研究较少，袁媛[33]研究了微波辅助水提醇沉法萃取苦瓜多糖，确定萃取工艺为料液比为1:20，浸提时间为25min；微波功率为600W。这与传统浸提法、热回流法等相比所用时间短、萃取效率高。多糖的提取也可以采用超声波-微波协同提取的工艺，这样可以兼具两种方法的优点[34，35]。

1.3.3 酶提取法

提取多糖常用的酶有纤维素酶、蛋白酶、果胶酶和混合酶，其作用原理是使细胞壁和细胞间质中纤维素和果胶降解，从而有利于多糖的溶出[36]。吴笳笛[37]在苦瓜水溶性多糖的提取及脱蛋白实验过程中分别加入纤维素酶和中性蛋白酶，通过正交优化实验确定其最佳水解条件分别为：纤维素酶用量5%，提取温度50℃，pH值6.0；中性蛋白酶用量10%，水解时间48h，pH值7.0。通过双酶法与常规法的比较表明，双酶法提取水溶性苦瓜多糖，不仅使提取的工艺条件更为温和，并且多糖的产率及含量均有显著提高。酶法也可与其他方法联合使用，以提高多糖的提取效率。张利芳[38]确定了纤维素酶协同超声波法提取苦瓜多糖的最佳工艺条件，通过建立二次回归模型，认为纤维素酶协同超声波法是提高苦瓜多糖得率的有效途径。

1.3.4 其他潜在方法

采用超滤膜技术对多糖进行分级和浓缩，收率高、对多糖生物活性的破坏小，又没有传统有机溶剂法的试剂残留问题，目前该方法普遍成为活性多糖研究的重要手段[39]。陈灵等[40]采用截留相对分子质量为20000的中空纤维超滤膜，分离和浓缩灵芝多糖，可将发酵液中多糖浓缩近10倍。超滤技术还用于其他植物多糖的提取[41,42]，因此也可用于苦瓜多糖的提取。多糖提取过程中小分子糖是影响多糖纯度的主要因素之一，因此可以利用酵母菌发酵的方法去除单糖及双糖等寡糖，而多糖含量基本保持不变的原理，使多糖的纯度大幅提高，达到分离多糖的目的[43]。

2 苦瓜降血糖成分的评价

2.1 细胞反应方面的苦瓜降糖活性评价

胰岛素是体内主要的降血糖激素，由胰岛β细胞分泌，主要作用于肝脏、骨骼肌和脂肪组织，调控糖、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢和贮存。苦瓜活性成分通过保护胰岛β细胞，改善胰岛素抵抗，从而达到降糖作用。

苦瓜活性物质对STZ损伤的胰岛β细胞株（HIT-T15）有明显的修护作用。修复效果与药物作用成份和药物浓度都有关系。苦瓜皂苷对胰岛β细胞保护作用最明显，苦瓜皂苷与多糖的混合物次之，多糖最低[44]。苦瓜伤流液对胰岛 β 细胞株（HIT-T15）也有保护作用，其降糖机制与修复受损胰岛细胞、刺激胰岛素分泌相关[45]。苦瓜茎皂苷对STZ损伤的胰岛廇细胞株（RIN-m5F）有明显的修护作用[46]。苦瓜及其有效成分能防止或逆转四氧嘧啶对胰腺β细胞造成的自由基损伤，阻止胰岛功能下降，从而对糖尿病起到防治作用。苦瓜的此种作用与其抗氧化活性相关，但又不只是依靠抗氧化活性[47]。何新益[48]以SMC-7721肝癌细胞为模型细胞，发现苦瓜水提物对PPARδ和PPARγ受体有激活作用。

2.2 酶反应方面的苦瓜降糖活性评价

人类日常的饮食摄取以淀粉为主，其次为蔗糖，淀粉水解首先在胰α-淀粉酶作用下分解为寡糖，寡糖通过小肠上皮细胞刷状缘处α-葡萄糖苷酶作用于α-1,4糖苷键水解形成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类口服降糖药物，它能够延缓肠道碳水化合物吸收，减缓葡萄糖的生成及吸收，缓解高胰岛素血症，降低餐后高血糖，从而减少高血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，保护胰腺，改善并预防糖尿病并发症的发生和发展，以及治疗因碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病。

王琪等[6]建立了超声-微波法连续提取苦瓜皂苷和多糖的工艺，他发现苦瓜皂苷和多糖对α-糖苷酶均具有不同程度的抑制作用，且分别呈现显著量效关系，其IC50值分别为1.03mg/mL和10.73 mg/mL，苦瓜皂苷的抑制活性相当于阳性对照阿卡波糖的1/3。田力东[49]比较35个苦瓜品种的果肉和籽粒中皂苷含量及其对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的差异。不同品种的苦瓜果肉和籽中皂苷含量及其对α-葡萄糖苷酶抑制能力差异较大。35个苦瓜品种可以分为4大类群，各类群中苦瓜果肉和籽粒中的皂苷含量与其对α-葡萄糖苷酶抑制作用的相关性不显著，其原因既可能在于不同品种皂苷组成成分不同，也可能在于不同组织部位中皂苷组分存在差异。陈林[50]发现不同方法制备的苦瓜根提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性是不同的，其中利用水提取的抑制作用是最强的。

2.3 动物实验的苦瓜降糖活性评价

在研究苦瓜降血糖活性的过程中，利用高血糖动物模型是必要的。常用的高血糖动物模型主要有4种，即自发性遗传动物模型、化学物质诱导动物模型、转基因动物模型和胰腺部分切除动物模型。目前自发性遗传性动物模型多被国外作为对高血糖的研究采用的动物模型[51]，但自发性遗传性动物模型对动物的品系、种属及饲养与繁殖条件的要求严格，另外该模型价格昂贵且能提供给实验所需的数量有限，因此在实际应用上受到了一定的限制。具备来源广泛，诱发简便的化学性高血糖动物模型成为当前应用较广泛的模型。

李原[52]研究苦瓜水提取物与苦瓜渣对实验性糖尿病小鼠空腹血糖、糖耐量、血液各项生化指标的影响，发现两者均能降低实验性糖尿病小鼠的血糖值，且水提取物效果较好。苦瓜醇提取物对II型糖尿病小鼠的降血糖作用，苦瓜醇提取物可降低II型糖尿病小鼠的血糖，改善糖耐量，但也可导致血清白蛋白降低，临床上应用时应加注意[53]。苦瓜多糖对糖尿病小鼠有明显的降血糖作用，影响胰岛素分泌，使胰岛素抵抗指数显著升高，胰岛素敏感指标显著降低[54]。董英[55]比较了苦瓜水提多糖和苦瓜碱提多糖对糖尿病小鼠的降糖效果，大分子量苦瓜多糖的降糖效果较好，其机制可能是通过减弱STZ对胰岛β细胞的损伤或改善受损β细胞的功能，从而起到调节血糖的作用。李健[1]通过研究得出苦瓜总皂苷对高血糖模型的小鼠具有显著降低血糖作用以及抗氧化能力的恢复作用，且高剂量组在降血糖作用和恢复抗氧化能力的效果较好。柴瑞华[56]认为苦瓜总皂苷对患有肾上腺素性高血糖小鼠和四氧嘧啶性糖尿病家兔具有较好的降血糖效果，但对血糖正常小鼠及四氧嘧啶性糖尿病家兔的胰岛素无明显影响。苗明三[57]认为苦瓜总皂苷对小鼠肾上腺素所致高血糖模型、四氧嘧啶性糖尿病模型、胰岛素抵抗模型、大鼠链脲佐菌素糖尿病模型均有较好的疗效。盛清凯[58]用苦瓜降糖多肽-P将患有高血糖的小鼠进行注射，模型鼠的血糖和血清胰岛素均降低，胰岛素敏感指数及肝糖原、肌糖原含量增加，总胆固醇、高密度脂蛋白及甘油三酯下降。苦瓜多肽-P对患有Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖血脂具有降低作用。

3 结束语与展望

我国对苦瓜的研究起步较晚，加之苦瓜降血糖活性成分种类繁多，结构复杂，给相关研究带来一定的难度和挑战，提取分离方法会直接影响苦瓜活性的数量和质量，各种方法有利有弊，需要不断探索寻找更加高效、环保的方法，比较不同提取方法时不应局限于工艺参数和得率，还应涉及到多糖的纯度、结构和生物活性，两种或多种方法的联合使用往往能达到较好的提取效果。苦瓜降血糖成分的活性评价方法主要集中在酶、细胞和动物方面的方法，关于人体实验的研究还应进一步加强，从而真正的将苦瓜应用于糖尿病的治疗中。

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