长江口及邻近海域鮸鱼的遗传多样性分析

郭垚示 ，孙鑫序 ，张玉荣 ，楼宝 ，詹炜 ，毛国民 ，陈睿毅

（1.浙江海洋学院，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316000）

鮸鱼（Miichthysmiiuy）属鲈形目、石首鱼科、鮸鱼属，是一种暖温性底层鱼类，自然分布于我国及朝鲜沿海（庄平等，2006）。它肉质鲜美、营养丰富，系沿海常见的食用经济鱼类。长江口是我国渔业种质资源的宝库，水产种质资源丰富，栖息着多种名贵经济鱼类；同时也是我国著名的渔场之一，具有丰富的渔业资源。近年来，由于过度捕捞、环境污染等人类活动的干扰，长江口渔业资源急剧衰退，包括鮸鱼在内的主要经济鱼类的资源量显著下降（李美玲等，2009）。因此，开展长江口及邻近海域鮸鱼的种质资源及遗传多样性现状的研究，对长江口重要渔业种质资源的保护和合理开发利用具有极其重要的意义。

海洋物种的遗传多样性研究不仅对种质资源的保护和合理开发利用具有重要意义，同时，还能为渔业资源的管理和监测提供参考（Shui et al，2009）。因此，海洋物种的遗传多样性研究一直受到学者们的高度重视。现代分子生物测序技术的发展，基于基因序列测定的分子数据已经广泛应用于鱼类种群遗传分析的各个方面（董丽娜等，2011）。线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）具有结构简单、母性遗传、进化速度快、核苷酸替代率高等特点，已成为鱼类进化生物学和群体遗传学研究的有效工具（刘云国等，2009）。在线粒体基因组中，细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome coxidase subunitⅠ，COⅠ）序列进化速度较快且容易扩增，因此广泛应用于种群水平遗传多样性的检测（孙鹏等，2011）。

目前对鮸鱼的研究报道多集中于发育生物学和人工繁殖技术等方面（钟俊生等，2005；孙庆海等，2003；李明云等，2005；楼宝，2005），关于鮸鱼种群结构及遗传多样性的研究相对较少。国内学者彭志兰等（2010）利用AFLP分析了舟山近海野生亲鱼和人工繁育子一代的群体遗传多样性；Cheng等（2011）利用线粒体控制区分析了浙江海域6个鮸鱼群体的遗传多样性现状；夏月恒等（2013）利用Cytb初步分析了我国近海38尾鮸鱼的遗传多样性。长江口及邻近海域是鮸鱼重要的产卵场和栖息地，本研究利用COⅠ基因序列片段对长江口及邻近海域鮸鱼群体遗传变异进行分析，以期为长江口及邻近海域鮸鱼资源的合理开发利用提供科学的参考依据，并为将来其遗传育种与良种选育提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

实验用鮸鱼样品共60尾，于2011年分别采集自崇明 （31°81′N， 121°65′E，数量 30 尾，全长为 23.62～28.78 cm，体重为 157～262 g）和舟山（30°08′N，122°30′E， 数量 30 尾，全长为 19.72～25.78 cm，体重为107～232 g）沿海 （图1），经过形态学鉴定后取其尾鳍保存于95%乙醇中，运回实验室后保存，用于基因组DNA的提取。

图1 鮸鱼样本采集分布图

1.2 DNA的提取、PCR扩增及测序

基因组DNA采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取（TIANGEN，北京）。COⅠ序列的扩增参照Sun等（2012）的方法进行，稍加修改。扩增引物COⅠ-F（5’-TCA ACCAACCACAAA GAC ATT GGC AC-3’）和 COⅠ-R （5’-TAG ACT TCTGGG TGG CCA AAG AATCA-3’），由上海生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为50μL，其中包含模板 DNA 400 ng，10×PCR buffer 5μL，25mmoLMg2+4μL，2.5mmoL dNTPs 4μL，Taq DNA聚合酶 （Takara）1U，10mM的上、下游引物各2μL；反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45 s，52℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃再延伸7min。PCR扩增产物通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶纯化试剂盒回收（TIANGEN，北京）PCR产物，纯化后测序。

1.3 数据分析

采用 BioEdit7.0（Halletal， 2009）对DNA 序列进行编辑和人工核查；利用Clustal X 1.83（Thompson etal，1997）软件进行同源序列比对；DNA序列的碱基组成、多态位点数（S）、单倍型数（N）、核苷酸多样性（Pi）和单倍型多样性（Hd）等遗传多样性参数用MEGA 4.0（Tamura et al， 2007）和 DNASP 5.0 （Rozas etal， 2003）软件进行计算分析；在Arlequin3.1（Exoffier et al，2008）软件中进行AMOVA分析，计算群体间遗传分化系数（F-statistics，FST），检验其显著性水平（重复次数1 000），由公式Nm=（1-FST）/2 FST计算群体间的基因流Nm。通过中性检验分析鮸鱼的群体历史动态，采用Arlequin软件计算Tajima’D，Fu and Li’F，Fu and Li’D，以及 Fu’s Fs统计检验值，以检验群体是否显著偏离中性进化（Rozaset al， 2003； Exoffier etal， 2008）。

2 结果

2.1 线粒体COⅠ基因片段的序列分析结果

将所测得序列在GenBank中进行Blast比对，确定为鮸鱼线粒体的COⅠ基因部分序列。序列经比对分析后剪辑对齐，得到长度为599 bp的COⅠ基因片段。在所测的60条序列中，A、T、G、C碱基的平均含量分别为22.9%、26.9%、20.0%和30.2%。A+T的含量为49.8%，G+C的含量为50.2%，G+C的含量略高于A+T的含量（表1）。在密码子第一位，G和C的含量为53%；在密码子第2位，T的含量最高，为41%；而在密码子第3位，C含量最高，占总碱基数的46.7%，而G含量最低，只有10.6%。

表1 鮸鱼两个群体COⅠ基因片段碱基组成

2.2 单倍型分布及群体的多样性指数

对2个群体共60尾鮸鱼的COⅠ基因序列进行分析，共定义20种单倍型，存在22个多态性位点，产生23个突变。在所有的多态性位点中，简约信息位点（I）有7个，占总位点数的1.2%；单一位点15个，占总位点数的2.5%；平均转换与颠换比（Ti/Tv）为3.61，没有发现插入或缺失现象（表2）。Hap3、Hap11和Hap19为共享单倍型，分别包括3个、4个和34个个体，其余17个单倍型为单一群体独享。两群体的平均单倍型多样性（Hd）为0.676 8，核苷酸多样性（Pi）为 0.002 29，平均碱基差异（K）为1.374。各个群体的遗传多样性见表2，其中舟山群体的遗传多样性指数（Hd=0.749 4±0.08 4，Pi=0.002 38±0.000 51）均略高于崇明群体（Hd=0.602±0.104，Pi=0.002 18±0.000 52）。

表2 鮸鱼两个群体遗传多样性参数

表3 鮸鱼群体分子方差分析结果

2.3 群体遗传结构和历史动态数据分析

利用Arlequin3.1软件估算2个群体间的分化指数（FST）和基因交流值（Nm），结果表明崇明和舟山群体间有较高的基因交流值（Nm≈56），无明显的遗传分化 （FST=0.008 83，P＞0.05）（表3）。采用邻接法（NJ）构建的20个单倍型的分子系统树如图2所示。所有的单倍型被分成两个分支。NJ树的上侧分支中，14个单倍型聚为一支，其余6个单倍型构成另一支。中性检验Tajima′s D和Fu′s Fs结果如表4所示，2个群体的检验值均为负值且差异显著（P＜0.05），显示两群体经历群体扩张事件。

图2 基于鮸鱼COⅠ基因序列构建的NJ系统树

表4 鮸鱼群体的中性检验分析

3 讨论

3.1 单倍型及群体遗传多样性

本研究中，鮸鱼2个群体60个样本中，共检出22个多态性位点，定义了20个单倍型，其中Hap3、Hap11和Hap19为2个群体所共有，其中具有Hap19的个体数为34个，占总数的56.7%。推测Hap19很可能是较原始的单倍型类型，其他单倍型可能由此单倍型演变而来（图3）。长江口两个鮸鱼群体的平均单倍型多样性指数为0.677，平均核苷酸多样性为0.002 29，呈现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性水平。本研究的鮸鱼遗传多样性参数比Cheng等（2011）利用线粒体控制区分析的浙江海域6个鮸鱼群体的遗传多样性指数低（Hd=0.9933，Pi=0.0097）低，较之夏月恒等（2013）利用Cytb对黄海和东海的38尾鮸鱼遗传多样性的分析结果（Hd=0.960±0.020，Pi=0.002 71±0.000 30）也要低。分析其原因，可能是线粒体基因组不同编码区域的遗传变异速率不同有关，线粒体的COⅠ基因序列的变异速率要比Cytb和控制区的变异速率低引起的（Sbisàetal，1997）。

图3 鮸鱼单倍型中介连接网络关系图（崇明（白），舟山（黑））

Grant等（1998）根据群体的单倍型多样性指数（Hd）和核苷酸多样性指数（Pi）将海水鱼类大致分为4种类型：第一种类型是低的单倍型多样性与低的核苷酸多样性 （Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二种类型是高的单倍型多样性与低的核苷酸多样性；第三种类型是低的单倍型多样性与高的核苷酸多样性；第四种类型是高的单倍型多样性与高的核苷酸多样性。鮸鱼具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，应属第二种类型。这种遗传多样性模式在其他海水鱼类中如大泷六线鱼、银鲳、花鲈和松江鲈等也广泛存在（Habib et al，2011；彭士明 等，2009；Liu et al，2006；高天翔等，2013）。该类型表明鮸鱼种群可能处于瓶颈效应后的增长与突变积累时期，即鮸鱼可能是由一个小的种群经过扩张形成，快速的种群增长有利于单倍型多样性的增加，但没有足够的时间积累核苷酸的变异，因此导致了单倍型多样性指数较高而核苷酸多样性指数较低的遗传多样性模式（Bowen et al，2001）。中性检验结果表明所研究的鮸鱼群体经历过选择和显著扩张。单倍型中介连接网络关系图大致呈星状放射结构（图3），也提示种群所经历的扩张历史 （Cheng et al， 2011；Liu et al，2006）。

3.2 群体遗传分化和基因流

一般而言，海洋鱼类由于具有较大有效群体数量和迁移扩散能力而存在广泛的基因流和较低的遗传分化水平（Beheregaray etal，2001）。遗传分化系数FST是用来测量群体之间遗传分化的重要指标，在0到1的范围内，FST值越大，两种群的分化程度越高（杨金权等，2008）。本研究中，分子方差分析（AMOVA）结果表明，遗传变异主要来自群体内（99.12%），而群体间较小的遗传分化系数较小（FST=0.008 83，P＞0.05），表明这两个群体间无显著遗传分化。本研究结果与Cheng等（2011）和夏月恒等（2013）的研究结果基本一致。夏月恒等通过Cytb发现我国近海3个地点的鮸鱼群体未出现明显遗传分化，Cheng等分析浙江海域6个地理群体遗传结构发现仅存在微弱的遗传分化。基因流系数Nm反映种群之间的交流情况，当Nm＜1时，种群之间处于隔离状态；Nm＞1时，表明种群间存在一定的基因流动；当Nm＞4时，表明各群体为一个大的随机单元（Masatoshietal，2000）。本次研究得到的基因流系数Nm≈56，表明舟山跟崇明群体为一个大的随机单元。用邻接法构建的系统树和利用Network构建的网络图均显示不同地理来源的单倍型交错分布，没有明显的地理群聚和谱系结构。究其原因，一方面可能是由于舟山和崇明两个群体的地理间隔较小；另一方面由于长江口是鮸鱼重要产卵区，其生殖期由深水向近岸作洄游形成随机交配的群体；从而导致两个群体间具有广泛的基因交流，遗传同质性程度较高（庄平等，2006）。

群体遗传结构研究是进行某一群体长期的可持续保护和管理的重要组成部分，物种遗传多样性的高低与其适应能力、生存能力和进化潜力密切相关，遗传变异是有机体适应环境变化的必要条件（Yang etal，2007）。本研究发现两个群体遗传多样性水平相对较低，推测其可能是由于捕捞压力和环境恶化导致鮸鱼补充群体逐年减少、资源量下降，进而引起有效群体的数量、大小迅速下降，出现瓶颈效应，从而最终导致了群体遗传多样性水平的下降。同时，由于本研究仅采用了COⅠ分子标记以及分析的种群数量有限，可能未全面反映鮸鱼的遗传结构，因此下一步研究需要结合多个分子标记手段并增加采样范围，以期对鮸鱼遗传多样性水平、种群历史进行更深入的分析，从而更加准确评估其有效种群大小，制定和采取合理的保护和管理措施。

Beheregaray L B,Sunnucks P,2001.Fine-sclae genetic structure,estuarine colonization and incipient speciation in marine silverside fish Odontesthes argentinensis.Molecular Ecology,10：2849-2866.

Bowen B W,Bass A L,Rocha L A,et al,2001.Phlogeography of the Trumpetfishes(Aulostomus):ring species complex on a globalscale.Evolution,55(5):1029-1039.

Cheng Y,Jin X,Shi G,2011.Genetic diversity and population structure of miiuy croaker populations in East China Sea revealed by the mitochondrial DNA control region sequence.Biochemical Systematics and Ecology,39(4):718-724.

Excoffier L,Laval G,Schneider G,2008.Arlequin ver 3.1：an integrated software package for population genetics data analysis.University of Bern,Bern,Switzerland.

Grant W A S,Bowen B W,1998.Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes：insights from sardines and anchovies and lessons for conservation.Journal of Heredity,89(5):415-426.

Habib K,Jeong A D,Myoung J G,et al,2011.Population genetic structure and demographic history of the fat greenling Hexagrammos otakii.Genes and Genomics 33：413-423.

Hall T A,1999.BioEdit：a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT//.Nucleic acids Symposium Series,41：95-98.

Liu J X,Gao T X,Yokogawa K,etal,2006.Differentialpopulation structuring and demographic history of two closely related fish species,Japanese sea bass(Lateolabrax japonicus)and spotted sea bass(Lateolabrax maculatus)in Northwestern Pacific.Molecular phylogenetics and evolution,39(3)：799-811.

Masatoshi N,Sudhir K,2000.吕宝忠，钟扬，高莉萍，等.2002.分子进化与系统发育.高等教育出版社：76-98.

Rozas J,Sánchez-DelBarrio J C,Messeguer X,etal,2003.DnaSP,DNA polymorphism analyses by the coalescentand other methods.Bioinformatics 19：2496-2497.

SbisàE,Tanzariello F,Reyes A,et al,1997.Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis：identification of new conserved sequences and their functionaland evolutionary implications.Gene,205(1)：125-140.

ShuiB N,Han Z Q,Gao T X,etal,2009.Mitochondrial DNA variation in the East China Sea and Yellow Sea populations of Japanese Spanish mackerel Scomberomorus niphonius.Fisheries Science,75(3)：593-600.

Sun P,Shi Z H,Yin F,et al,2012.Genetic variation analysis of Mugil cephalus in China Sea based on mitochondrial COIgene sequences.BiochemicalGenetics,50：180-191.

Tamura K,J Dudley,M Nei,etal,2007.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0.Molecular Biology and Evolution,24：1596-1599.

Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,Jet al,1997.The CLUSTAL-X windows interface：flexible strategies for multiple sequence align－ment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research,25：4876-4882.

Yang P,Zhang H,Chen L,et al,2007.Genetic structure of the Oriental river prawn(Macrobrachium nipponense)from the Yangtze and Lancang Rivers,inferred from COI gene sequence.Zoological Research,28（2):113.

董丽娜,黄梓荣,艾红,等,2011.北部湾3种金线鱼属鱼类COI基因序列的比较分析.中国水产科学,18(3):508-514.

高天翔,毕潇潇,赵林林,等,2013.基于线粒体Cytb基因全序列的松江鲈群体遗传结构分析.水生生物学报,37(2):199-207.

李美玲,黄硕琳,2009.关于长江口渔业资源管理的探讨.安徽农业科学,37(13):6196-6198.

李明云,郑忠明,竺俊全,等,2005.鮸鱼亲鱼培育及其人工繁殖的研究.水产科学,(9):32-34.

刘云国,刘贤德,高焕,2009.水产生物DNA分子标记技术.北京：科学出版社.

楼宝,2004.鮸鱼的渔业生物学和人工繁养技术.渔业现代化,(6):11-13.

彭士明,施兆鸿,侯俊利,等,2009.银鲳3个野生群体线粒体COⅠ基因的序列差异分析.上海水产大学学报,18(4):398-402.

彭志兰,柳敏海,傅荣兵,等,2010.舟山鮸鱼群体遗传多样性的AFLP研究.上海海洋大学学报,(2):172-177.

孙鹏,尹飞,彭士明,等,2011.条石鲷线粒体COⅠ和Cytb序列的遗传变异分析.水产学报,35(3):327-333.

孙庆海,陈诗凯,2003.鮸鱼规模化繁育技术研究.浙江海洋学院学报(自然科学版）,22(3):273-276.

夏月恒,章群,高志远,等,2013.中国近海鮸鱼遗传多样性的细胞色素b全序列分析.广东农业科学,40(3):101-105.

杨金权,胡雪莲,唐文乔,等,2008.长江口邻近水域刀鲚的线粒体控制区序列变异与遗传多样性.动物学杂志,43(1):8-15.

钟俊生,楼宝,袁锦丰,2005.鮸鱼仔稚鱼早期发育的研究.上海水产大学学报,14(3):231-237.

庄平,王幼槐,李圣法,等,2006.长江口鱼类.上海:上海科学技术出版社.