模式小鼠总DNA三种提取方法比较

刘甦苏，左 琴，周舒雅，王辰飞，贺争鸣，李保文，范昌发

(中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050)

随着基因工程技术的不断发展和完善，基因工程小鼠越来越多的应用于生命科学研究中，已渗透到医学、发育生物学、遗传学、动物育种学等各个领域。模式小鼠模型在繁殖建系过程中，需要不断对其子代进行基因型鉴定，因而建立快速、稳定、准确、经济的基因型鉴定方法很有实际应用价值[1-2]。southern印迹杂交、斑点杂交和聚合酶链式反应(PCR)[3]是模式动物基因型鉴定常用的方法，而后者因操作简单快速，应用更为广泛[4]。引物设计是PCR实验的关键之一，其中反应产物长度直接影响扩增效率。以总DNA为模板的普通PCR反应，引物设计时产物长度在100～600 bp为宜[5-6]。在批量模式小鼠的基因型鉴定中，总DNA的提取工作量较大，耗时耗力，而PCR 模板的DNA得率和纯度直接影响基因型鉴定的准确性和效率，因而有必要对其进行探索。本文以常规PCR片段长度为例，采用苯酚抽提法[7]、异丙醇沉淀法[8]、鼠耳煮沸法提取模式小鼠基因组DNA，测定其OD260与OD280的吸光值, 评估核酸的纯度和得率，并通过PCR方法进行模式小鼠基因型鉴定，旨在确立更加实用的基因型鉴定方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

模式小鼠选取本单位自主建立C57-ras模型小鼠【SCXK(京)2009-0017】，饲养于国家啮齿类实验动物种子中心【SYXK(京)2011-0005】，繁育环境为SPF级，饲养和实验在清洁级环境中进行。本实验在中国食品药品检定研究院实验动物伦理委员会监督下进行。

1.2 仪器与试剂

鼠尾裂解缓冲液储存浓度(0.2 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 5 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.2 % SDS, 10 mg/mL蛋白酶K)，鼠耳裂解10倍母液[100 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)]，常用缓冲液TE buffer、TAE buffer 按照《分子克隆》手册配置；Tris平衡酚购自于天津灏洋生物制品公司，RNase A和蛋白酶K购自于大连宝生物，其它常见生化试剂乙醇、异戊醇、异丙醇、氯仿购自北京化学工业集团有限公司。1.5离心管和PCR管及盖购自于AXYGEN。检测仪器为美国ABI PCR仪，Thermo nanodrop 2000微量紫外分光光度计。引物由诺赛基因公司合成。

1.3 基因组DNA提取的方法

选取C57-ras模型小鼠10只，分别留取相应组织分别用以下三种提取基因组DNA

1.3.1 方法一苯酚抽提法：

(1) 剪取约1 cm鼠尾置于1.5 mL的离心管中

(2) 每管加入配制好的250 μL裂解液和5 μL蛋白酶K，55℃水浴过夜

(3) 每管加入250 μL Tris平衡酚。室温离心2 min取上清至另一个新的EP管中

(4) 加入等体积氯仿：异戊醇(49:1)充分混匀后，室温离心2 min取上清至新的EP管中

(5) 加入25 μL醋酸铵和500 μL异丙醇, 试管上下颠倒混匀，室温离心10 min，弃上清

(6) 冷藏的75%乙醇轻混后漂洗一次，离心弃上清风干，加入TE和RNase A，55℃水浴溶解2 h

1.3.2 方法二异丙醇沉淀法：

(1) 剪取约1 cm鼠尾置于1.5 mL的离心管中。

(2) 每管加入配制好的500 μL裂解液(含蛋白酶K 5 μL，稀释终浓度：100 μg/mL)，55℃水浴过夜

(3) 取出室温放置10～15 min，室温离心15 min后，吸取上清至另一个新的EP管中

(4) 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10 min，离心后弃上清

(5) 冷藏的75%乙醇轻混后漂洗一次，离心后弃上清液风干，加入TE和RNase A，55℃水浴溶解2 h

1.3.3 方法三鼠耳煮沸法：

(1) 先配制2种10制母液100 mmol/L NaOH和1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，分别于试剂瓶中常温保存。两种母液混合并分别稀释10倍，配制成使用液(现用现配)

(2) 剪取约1 cm鼠尾置于1.5 mL的离心管中

(3) 每个样品加入现配的裂解液，95℃加热10 min，降至室温后直接吸取上清作为模板进行PCR反应

1.4 总DNA琼脂糖凝胶电泳及质量检测

分别采用紫外分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳法, 检测所得DNA 的得率和质量。DNA经TE稀释后分别取1.5 μL，用紫外分光光度计测定260和280 nm的光吸收值, 计算DNA 得率及纯度。电泳检测取2 μL总DNA与6×loading buffer 按比例混匀。用1% 的琼脂糖凝胶( 含0.5 μg/ mL EB) 电泳检测。

1.5 PCR反应扩增检测

分别以三种方法提取的总DNA，通过PCR反应进行基因型鉴定。引物设计针对转基因的编码序列，上游引物为Pri. PFT，下游引物为Pri. PRN1735(表1)，目的片段408 bp。PCR 条件为：95℃ 5 min变性；95℃ 30 s；62℃30 s，72℃ 30 s，30 个循环。产物取5 μL用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR反应引物序列及退火温度

表2 三种不同基因组DNA 提取方法结果比较

2 结果

2.1 总DNA得率和纯度

选取10只C57-ras阳性鼠分别用三种方法提取总DNA，计算得率和纯度，结果表示方式为平均值±标准差。总DNA 得率方面，苯酚抽提法最高，其最高值能达到48.92 μg, 平均得率为35.32 μg，而异丙醇沉淀法得率最低，平均得率仅为10.38 μg，鼠耳煮沸法介于二者之间平均得率为25.59 μg。在衡量DNA 纯度方面，测定光吸收比值是一个重要指标[9]，三种提取方法呈现一个递减的趋势，结果与理论值一致。苯酚抽提法和异丙醇沉淀法比值差异不大，平均值分别为1.81和1.7，鼠耳煮沸法所提取的总DNA纯度最差，平均比值为1.58(表2)。

2.2 总DNA电泳检测结果

取等量总DNA采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。结果表明，方法一和方法二的总DNA 质量较好，每个样品都有清晰的条带，方法三提取的效果最差，电泳检测无清晰的条带。

2.3 PCR反应扩增目的条带结果

根据设计引物PCR扩增ras基因，不同DNA模板本都出现清晰目的条带(图2)，表明三种方法提取的DNA均完全可以做为PCR反应的模板，达到筛选转基因阳性鼠的实验目的。

2.4 鼠耳煮沸法提取的DNA保存方法比较结果

鼠耳煮沸法提取的DNA采用常规-20 ℃保存7 d、30 d后重复PCR扩增反应，依然出现清晰目的条带(图3)，说明该方法所提取的DNA可以保存一个月左右时间，在不能及时开展后续实验时依然适用。如果长时间样品最好存放于-80℃超低温冰箱内。

注：A苯酚抽提法；B异丙醇沉淀法；C鼠耳煮沸法；Marker：λ-EcoT14。

注：A 苯酚抽提法；B 异丙醇沉淀法；C 鼠耳煮沸法；Marker：D-2000。

注：A图是鼠耳煮沸法提取的DNA保存0 d的PCR实验扩增结果；B图是鼠耳煮沸法提取的DNA保存7 d的PCR实验扩增结果；C图是鼠耳煮沸法提取的DNA保存30 d的PCR实验扩增结果，保存条件均为-20℃保存。Marker为D-2000。

2.5 三种提取方法耗费时间比较

选取10只C57-ras阳性鼠，计算三种方法提取总DNA的时间并进行统计分析。苯酚抽提法和异丙醇沉淀法的提取时间分别为12.5 h和13 h极显著(P< 0.01)高于鼠耳煮沸法0.18 h。虽然苯酚抽提法的提取时间低于异丙醇沉淀法，但差异无统计学意义(P> 0.05)(表3和图4)。

表3 三种不同提取方法实验时间结果比较

图4 三种不同提取方法实验时间比较

3 讨论

为了维系国家啮齿类实验动物种子中心日常工作，常常面临批量模式小鼠基因型鉴定。建立简便、快捷、经济的总DNA提取方法能有助于提高工作效率。常见提取总DNA 的方法有苯酚抽提法、碱裂解法、盐沉淀法等。肖波[10]等对苯酚抽提法和盐沉淀法[11]进行过相关比较。本文比较分析了苯酚抽提法、异丙醇沉淀法和鼠耳煮沸法三种方法。

苯酚抽提法DNA得率最高，异丙醇沉淀法最低；纯度则是苯酚抽提最好，鼠耳煮沸法最差。三种方法提取的总DNA均可作为PCR反应的模板，达到基因型鉴定目的。苯酚抽提法和异丙醇沉淀法提取的DNA纯度较好，但在批量鉴定时费时费力，基因型工作易出现延误工作的情况。综合比较成本，效果后发现，鼠耳煮沸法有以下优点：

3.1 操作步骤简便，减少交叉污染

苯酚抽提法操作繁琐且所用试剂品种较多，增加了PCR 污染的可能性。改进后的异丙醇沉淀法，减少了酚/氯仿抽提步骤，降低了操作风险和交叉污染的可能性。鼠耳煮沸法操作步骤更为简单，煮沸后上清可直接进行PCR反应，进一步减少各样品交叉污染的几率。

3.2 缩短实验周期，快速筛选鉴定

苯酚抽提法和异丙醇沉淀均需过夜消化样本，异丙醇沉淀法虽减少了酚/氯仿抽提步骤，但同样第二天才获得实验结果；鼠耳煮沸法缩短了实验周期，当天即可筛选鉴定。

3.3 降低实验成本，避免操作风险

苯酚抽提法使用试剂较多且酚类物质有高度腐蚀性, 易引起严重的烧伤[12]。鼠耳煮沸法只需2种普通试剂且价钱便宜，避免了乙醇等有机溶剂或浓缩盐的介入，实验成本较低且无操作风险。

综合比较，鼠耳煮沸法在批量筛选、快速鉴定模式小鼠基因型鉴定工作更为实用。

参考文献：

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