新型小鼠跨区供血耳瓣模型的构建

梁 成，庄跃宏，郑和平，吴剑威，马 雷，谢志平

(1.福建医科大学福总临床医学院(南京军区福州总医院)比较医学科，福州 350025;2.福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系，福州 350108)

肿瘤切除、烧伤，特别是交通伤等引起的较大面积软组织缺损，面积往往超过单个轴形皮瓣的覆盖能力，临床医生根据缺损修复的需要，将皮瓣扩大切取，超出解剖供区的限制，甚至到达远邻的潜力供区,这就是所谓的跨区皮瓣[1]。跨区皮瓣切取后，皮瓣需跨过血管体之间的吻合血管，也就是Taylor[2]认为的choke血管向皮瓣远端供血。生理状态下吻合血管管径极其细小，是跨区皮瓣切取后血流以足够的速率与量通往远端的最大障碍，因此皮瓣能完全存活的关键在于不同区域间的吻合血管是否都能扩张成为真性吻合。因此，对跨区皮瓣血管体间的choke血管在皮瓣切取后的生物学变化进行深入研究，对提高跨区皮瓣的存活率有重要的意义。目前，几种研究choke血管的动物模型，均存在较明显的缺陷[3-5]。本研究在观察小鼠耳的血管分布情况后，在小鼠耳上切取跨三区皮瓣，不仅成功观察到吻合区血管的形态变化过程，也得到一稳定的皮瓣坏死模型，为以后进一步研究血管扩张机制及遴选促皮瓣存活药物的理想动物模型奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 可编程数控二维精密图像采集系统设计

可编程数控二维精密图像采集系统(图1)。包括：十字滑台、数控两轴运动控制器、步进电机驱动器、步进电机、电源、动物承载台、体视显微镜，数码相机。①十字滑台：精度0.01 mm；②控制器：可编辑程序；③动物承载台(图2)：载物台的中间镂一直径为2 cm的圆孔，主要用来增加透光性。圆孔上粘贴一块(3×2×0.4)cm的小有机玻璃板，主要用于放置鼠耳。在小有机玻璃板的两侧粘两小有机玻璃条，比中间小有机玻璃板高1 mm便可，用于放置载玻片压平鼠耳，但又不至于阻断鼠耳血供；④体视显微镜(moticam 1300)；⑤数码相机(OLYMPUS SZ-16)。

注：1. 置耳台；2.玻片台；3，玻片。

由于滑台的高度与轴长限制，与显微镜物距无法匹配，决定了动物承载台和滑台不能直接组合置于物镜下。因此，必须要做一个足够面积的有机玻璃托板，将动物承载台连接并间接固定在滑台上，通过滑台的往复运动,带动动物承载台运动，从而巧妙地实现鼠耳按“弓”型路线准确步进。

1.2 实验动物

30只清洁级ICR小鼠，雄性，体重25～30 g，鼠耳完整无皮肤病变或外伤，由福建医科大学动物中心【SCXK(闽)2012-0001】提供；饲养于南京军区福州总医院比较医学科屏障环境【SYXK(闽)2013-0004】，环境温度22±1℃，相对湿度40%～65%。

1.3 模型建立

用戊巴比妥钠(45 mg/kg)将小鼠麻醉成功后，商业人用脱毛膏鼠耳脱毛并用流水冲净，体视显微镜下(×25)观察鼠耳的血管分布情况。根据观察结果，用眼科剪从尾侧向头侧剪断小鼠耳基底部尾侧2/3，保留头侧1/3，形成以耳前动静脉为蒂内含三个血管体、二个choke区的跨区供血耳瓣。

1.4 图像采集

小鼠麻醉成功后，侧卧置于图像采集系统的动物承载台上，鼠耳盖上载玻片，尽量展平鼠耳。调节体视显微镜物镜并固定为25倍；设置步进参数，使动物承载台在X、Y轴上步进距离0.25 cm/次,间隔时间为5 s，行进路线为“弓”型。动物承载台每移动一次采集一次图像，每只小鼠整耳大概需采集10张图像。图像采集时间点为耳瓣切取后0,1,2,3,4,5,6,7,10,14,21,30 d。

1.5 数据测量及统计分析

2 结果

2.1 鼠耳的血管分布

鼠耳面积约为1.5×1.3 cm，厚度约为0.3 mm，透光度好。在体视显微镜下清晰可见3条血管束：尾侧血管束、中间血管束及头侧血管束。每个血管束均有一条动脉与相伴行的静脉，动脉直径为0.2～0.5 mm，静脉直径为0.9～2.1 mm。头侧血管束进入鼠耳基底部后，沿着鼠耳前侧缘走行。尾侧血管束在整个走形过程中分支较少，末端与中间血管体的内侧分支吻合。中间血管体在进入基底部后往往分为三大支，中间支垂直向上走行，内侧支往内侧走行，与头侧血管体吻合；尾侧血管体在进入基底部前往往分为两支，两支一并进入耳体，与中间血管外侧分支往往有细小吻合。头侧血管体与尾侧血管体分别约供应1/4的耳体，中间血管体约供应1/2的耳体(图3A)。

2.2 耳瓣内血管管径变化及坏死面积

术后即刻，耳瓣透光性最佳，动静脉均清晰可见。术后24 h，便可以观察到第三血管体所供应的区域出现部分坏死的征象：高倍镜(×100)下可见血管内无血液流动，组织脱水，血管周围出现众多红斑，为溢出的红细胞。术后4 d，耳瓣水肿较为厉害，致使其透光性有所降低，在显微镜下耳瓣整体较为暗淡，静脉依然较为清晰，但动脉观察则有点困难。术后5 d，耳瓣坏死面积趋于稳定，坏死率为(15±7)%(彩插5图3B )。耳瓣术后，头侧血管体与中间血管体之间的choke动、静脉的管径出现快速扩增，两者都在第10天左右达到最大，choke静脉管径最高峰可到达原来的(3.9±0.5)倍，choke动脉管径最高峰可达到原来的(3.5±0.7)倍。10 d后，choke静脉管径开始减小，21 d后逐渐平稳，而choke动脉管径于术后10 d左右开始平稳，之后无明显减小(图4)。在中间血管体与尾侧血管体之间扩张的choke血管数量及幅度多小于第一choke区，在少数出现较明显扩张的耳瓣中，第三血管体所支配的区域坏死率出现明显降低(彩插5图5)。耳瓣切取后30 d内，很多小鼠鼠耳上可以观察到第二血管体内的静脉除了与头侧血管体直接相连的内侧分支管径增加后处于一个较平稳的状态，其它两个分支内的静脉在耳瓣切取后4 d左右，由于静脉回流障碍出现的静脉被动扩张，而后期耳瓣皮瓣血供重构稳定后，扩张的静脉明显萎缩、退化，管径比耳瓣切取前减小。皮瓣会出现一个明显的静脉回流轴向，尾侧血管体内的未坏死部分的静脉在耳瓣基底部通过细小的静脉连到第二血管体的基部，后通过第二血管体的内侧分支直接到内侧血管体。

图4 choke血管管径变化趋势

3 讨论

3.1 跨区供血皮瓣的概念及本实验结果对其存活机制的提示

人体皮肤的每一支动脉均有一个明确的供血范围，即解剖学供区。每一个解剖学供区与其周围相邻动脉之间均有丰富的吻合，Taylor等[2]将这种吻合称为choke血管。一侧血管被切断或阻断时，其管道内血压下降，此时，解剖学供区血管内的血流就会跨越原来的吻合部位(choke vessels)向远端供血。这种紧邻解剖学供区的扩张部分被称之为血流动力学供区(dynamic territory)。在跨越动力学供区的基础上，若再继续向远邻的供区延伸，则称其为潜力供区(potential territory)。这表明：可将皮瓣从解剖学供区向紧邻的动力学供区扩张切取，若再继续向远邻的潜力供区延伸，则可得到更大的皮瓣[1]，这就是所谓的跨区供血皮瓣。临床经验及动物实验提示跨区皮瓣切取后，动力供区往往能够顺利存活，而皮瓣坏死最容易出现在动力供区与潜力供区之间choke区及其远端潜力供区部分，其原因有待深入研究[7]。

耳瓣切取后，耳瓣内静脉在早期均出现明显的扩张，而后期很多扩张静脉又出现回缩，管径较小，甚至消失，提示耳瓣内静脉早期的扩张可能属于被动扩张，可能是静脉回流瘀滞的一个表现。皮瓣切取后7 d左右，慢慢就能看到耳瓣内一个明显的静脉回流轴向：尾侧血管体内的未坏死部分的静脉在耳瓣基底部通过细小的静脉连到第二血管体的基部，而后通过第二血管体内侧分支直接到头侧血管体，耳瓣内静脉似乎都是选择以最短距离回到蒂部。而皮瓣动脉没有明显的管径增加又回缩的现象，提示动脉扩张早期可能是因为失神经或者代谢产物积累、缺氧等原因造成血管的扩张，只是弹性的扩张期，之后出现动脉壁细胞的增值，属于主动增值。

3.2 耳瓣模型的优缺点

耳瓣模型与目前文献上报道的用于跨区供血皮瓣研究的动物模型相比有以下优点：⑴耳瓣切取后，耳瓣内整个血管的形态学变化可在活体上长时间观察，明显优于文献上报道的在大鼠或兔子背部切取皮瓣，再按照时间点分批处死动物进行血管造影的方法。目前文献上报道的动物皮窗模型是另外一种能够实现对皮瓣切取后皮瓣内血管形态学活体长时间观察的方法[3-4]。小鼠耳瓣模型与皮窗模型相比有较明显的优点: ①不用安装皮窗，避免了很大的一个干扰因素；②避免皮下组织直接暴露于皮下，大大减小动物的感染率和致死率，提高模型的成功率；③操作方便，不用安装皮窗，不用缝皮，与每只大鼠皮窗模型至少需30 min制作相比，耳瓣模型从耳瓣制作到照片合成完毕只需5～8 min；⑵耳瓣内坏死与成活的组织界限清晰可见，耳瓣坏死率容易精确计算。我们认为该模型是最好的用于筛选具有血管活性，能促进皮瓣存活的药物；⑶小鼠耳成对，可互相作为对照组。小鼠耳瓣模型作为跨区皮瓣模型最大的缺点在于鼠耳属于复合组织，除了皮肤还有软骨，与单纯的皮瓣相比，其生理可能存在不同。

3.3 鼠耳模型建立要点

耳瓣模型的制作过程中需注意以下两点：①当耳瓣切取后，由于疼痛，小鼠具有相互啃咬的天性，不恰当的圈养会导致小鼠相互啃咬耳瓣，并增加小鼠耳瓣感染可能性，使试验功亏一篑，本模型中必须保证所有小鼠单独饲养；②不恰当的放置盖玻片会压瘪甚至截断鼠耳中正常的血流，影响试验的统计，所以两侧的架高条的高度必须适中，给盖玻片和鼠耳留有一定空间，既能保证鼠耳铺平又能保证血流通畅。

综上所述，本课题建立的鼠耳模型能清晰的对跨区皮瓣微循环的形态学变化进行长时间的活体观察，并具有稳定坏死率，不失为研究血管扩张机制及遴选促皮瓣存活药物的理想动物模型。

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