自噬对HIV-1 gp120V3环介导的海马神经元L型钙离子通道电流的影响*

汪军兵， 林丽清， 江明亮， 陆大祥， 陈桂玲， 行妍妍， 董 军 △

(1广州市番禺区中心医院，广东 广州 511400； 暨南大学医学院 2病理生理学教研室， 3国家中医药管理局病理生理学三级科研实验室，广东 广州 510632 )

自噬(autophagy)是细胞内某些胞质成分通过一系列严格调控的途径，最后被溶酶体内蛋白酶降解，释放出大分子物质再循环的过程。巨自噬[1](macroautophagy)是指胞质成分被囊泡样双层膜结构的自噬体包裹后，再与溶酶体融合成自噬溶酶体进行降解，此种类型在自噬的3种方式中最为多见，本文提及的自噬均指巨自噬。有关自噬的信号转导通路较为复杂，其中研究得最多的是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)依赖性信号通路。

HIV-1 gp120是人类免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1, HIV-1)表达于病毒表面的包膜糖蛋白，HIV-1 gp120V3环是其5个可变区之一，是HIV-1病毒辅助受体的特异性和细胞嗜性的主要决定因子，参与组成辅助受体结合位点，而且V3环还参与gp120与辅助受体结合过程并在其中起主要作用[2]。艾滋病感染者中40%～60%会发展为HIV相关神经认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorder, HAND)，其机制至今尚未完全阐明。HIV-1 gp120是神经元损伤的一个重要因素，以HIV-1 gp120作用于神经元是研究HAND损伤机制的一个常用细胞模型。

在哺乳动物的中枢神经系统中至少存在6类电压门控钙离子通道，L型Ca2+通道是其中之一，它是导致细胞钙离子内流的主要因素[3]。本室前期研究已经证实[4]，HIV-1 gp120V3环可引起原代培养的海马神经元凋亡，且参与L型Ca2+通道电流的改变；然而，关于mTOR依赖性自噬信号转导通路对HIV-1 gp120V3环介导的海马神经元L型钙离子通道电流的影响尚未见报道。

本实验以HIV-1 gp120作用于原代培养的海马神经元，同时加入mTOR依赖的信号转导通路的抑制剂及激动剂，以全细胞膜片钳记录L型Ca2+通道电流，旨在研究自噬中mTOR依赖性信号转导通路对HIV-1 gp120V3环介导的海马神经元L型钙离子通道电流的影响，从而为临床上HAND的防治提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

gp120V3环购自Raybiotech；3-MA购自Sigma；rapamycin购自StressMarq；Neurobasal 培养基及B27购自Gibco；多聚赖氨酸购自Sigma。电极外液组成： NaCl 120，CsCl 5，TEA-Cl 10，BaCl210，HEPES 10，MgCl21，TTX 0.0005。电极内液组成：CsCl 120，MgCl22，Na2ATP 5，HEPES 10，glucose 11，EGTA 11。

2 细胞培养和实验分组

取新生24 h内SD乳鼠，用装有75%乙醇的喷壶喷满乳鼠全身，无菌环境下开颅分离双侧海马，置预冷PBS 液中洗涤3遍去除血液，然后转入20 mL小玻璃瓶中，眼科剪剪碎，再转入无菌100 mL输液瓶中，加入相当于海马组织总体20倍左右的DMEM/F12液与0.25%胰蛋白酶混合液(1∶1)，置37 ℃培养箱消化15 min，中间吹打2次，每次20 s，再加入胎牛血清1 mL终止消化，分别用200目和400目不锈钢筛网过滤去除组织块，吸取滤过液， 4 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清，加完全培养液重悬细胞，收集悬液，取5 μL悬液以1∶1体积加入台盼蓝染色，观察细胞存活状态，调整细胞浓度5×108/L，种植于经10 % 多聚赖氨酸包被的petri皿内，4 h全量换液，更换为含2% B27的Neurobasal培养基继续培养(Neurobasal培养基-2%B27条件培养基可抑制胶质细胞分裂生长，促进海马神经元生长成熟)，之后每3 d半量换液1次，取培养7 d 的海马神经元用于实验。

实验分为2个平行实验组，即空白对照组、gp 120V3组、自噬阻断剂3-MA组和gp120V3+3-MA组；空白对照组、gp120V3组、自噬激动剂rapamycin组和gp120V3+rapamycin组。

3 全细胞记录

玻璃毛坯经P97微电极拉制仪经三步法拉制成尖端直径为2～3 μm的电极，冲灌电极内液。去培养液，以电极外液轻洗去杂质，换上电极外液，将皿置于倒置显微镜载物台上，20倍物镜找到胞体光亮饱满的神经元，冲灌玻璃微电极并将其安装在放大器探头的电极夹持器上，在电压钳模式下用微操纵器引导玻璃微电极靠近细胞，在电极入液后始终给予5 ～6 cm H2O的正压，以防尖端堵塞。将微电极尖端调整至胞体正上方，然后在持续正压的同时让电极尖端缓慢靠近细胞，利用特定的测试方波判断细胞的封接状态。待电极尖端接触细胞表面时，显示的方波会因封接阻抗增大而产生相应变化，轻轻给予电极内负压，形成高阻封接(1 GΩ)，此时形成贴附式膜片(cell-attached patch)，正确补偿电容后稳定1 min，再给予负压吸破电极尖端的细胞膜，此处细胞内、外液相通，补偿电容电流和串联电阻，形成全细胞膜片钳(whole-cell patch)，稳定3～5 min进行记录。实验中的串联阻抗在进行补偿时可由放大器面板直按读出，并被补偿65%～75%。电流信号经Ag/AgCl电极引导，数据经Digtal 1320A转换器记录，采样频率为5 kHz，滤波频率为1 kHz。记录时，将高阻封接的细胞电位钳制在-50 mV持续300 ms，阶跃10 mV的10个去极化电压钳制记录L-型Ca2+通道电流-电压曲线。实验中钳制电压和电路电阻随时被检测，只有基线、钳制电压和电路电阻稳定的数据才被纳入分析数据。

4 统计学处理

数据应用Clamfit 10.2软件和SPSS 13.0软件进行数据处理和作图，所得电流利用膜电容标化后以电流密度(pA/pF)表示，绘制I-V曲线。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用完全随机设计单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 自噬抑制剂3-MA对gp120V3环作用的海马神经元L-型钙离子通道电流的影响

由电压步阶产生的内向L型钙离子通道电流在原代海马神经元培养7 d后被记录，从-50 mV～+40 mV的电压步阶产生的L型Ca2+通道电流在空白对照组、gp120V3(1 mg/L)组、3-MA(5 mmol/L)组和gp120V3+3-MA组经膜电容标化后峰值电流密度(pA/pF)平均值分别为-9.63±1.43、-16.06±1.57、-19.15±2.21和-22.55±2.08；gp120V3组及3-MA组与空白对照组比较，有显著差异(P<0.05),说明加入gp120V3环或加入3-MA均可使海马神经元的L型钙离子通道电流增强；gp120V3+3-MA组与gp120V3组比较，有显著差异(P<0.05)，提示加入3-MA抑制自噬后可使受gp120V3环作用的海马神经元的L型钙离子通道电流增强，见图1。

2 自噬激动剂rapamycin对gp120V3环作用的海马神经元L型钙离子通道电流的影响

由电压步阶产生的内向L型钙离子通道电流在原代海马神经元培养 7 d后被记录，从-50 mV～+40 mV的电压步阶产生的L型钙离子通道电流在空白对照组、gp120V3(1 mg/L组)、rapamycin(2 μmol/L)组和gp120V3+rapamycin组经膜电容标化后峰值电流密度(pA/pF)为9.63±1.43 、-16.06±1.57、-5.68±0.48和-7.46±0.83，gp120V3组及rapamycin组与空白对照组比较，有显著差异(P<0.05),说明加入gp120V3环可使海马神经元的L型钙离子通道电流增强，加入rapamycin可使海马神经元的L型钙离子通道电流减弱；gp120V3+rapamycin组与gp120V3组比较，差异显著(P<0.05)，提示加入自噬激动剂rapamycin后可使受gp120V3环作用的海马神经元的L型钙离子通道电流减弱，见图2。

Figure 2. The effect of autophagic excitor rapamycin on the peak current amplitude of hippocampal neurons treated with gp120V3 loop. A： voltage steps of L-type calcium channel; B： the average peak current amplitude in different groups; C： I-V curves of peak current density in different groups; D： bar chat of peak current density in different groups. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs gp120V3 group.

讨 论

自噬具有双重功能，当自噬在对不同形式的细胞应激作出反应时可被快速上调，这种快速的自噬诱导可以通过清除细胞内受损的细胞器、毒性代谢分子及细胞内的病原体，并通过产生维持细胞重要功能所必需的细胞内构件，以利于细胞的生存，但自噬的持续性激活也可导致细胞最终发生自噬性细胞死亡[5]。

在自噬的信号转导通路中，mTOR信号通路是研究得最多的一条，它包括AMPK/mTOR和ERK/ mTOR和PI3K-Ⅰ/ mTOR，但这3类均要通过信号分子mTOR。AMPK可抑制mTOR，对自噬起增强作用，ERK和Ⅰ型PI3K激动mTOR，对自噬起抑制作用[6]。Rapamycin是自噬激动剂，它可与靶点mTOR结合抑制其活性，从而增强自噬。3-MA是Ⅲ型PI3K的抑制剂。Ⅲ 型PI3K位于mTOR信号转导通路下游，它与beclin 1形成复合物参与自噬体的形成，对自噬起到促进作用，故3-MA可抑制自噬，是科研实验中广泛使用的一种自噬阻断剂[7]。

HIV-1 gp120是HIV-1的一种包膜糖蛋白，可致神经元凋亡[8]，但对神经元自噬的影响报道较少。Zhou等[9]以gp120作用于神经母细胞瘤SK-N-SH细胞6 h，发现细胞自噬增强。

HIV-1 gp120既可引起海马神经元自噬增强，亦可导致海马神经元凋亡，这其中自噬与凋亡的关系还未研究清楚。Qin等[10]将自噬和凋亡的标记物共同标记在同一神经元或胶质细胞上，发现自噬与凋亡同时存在，但损伤后不同时间内自噬与凋亡阳性细胞数不同，伤后短时间以自噬为主，随时间延长则以凋亡为主。

在本实验中，加入gp120V3环后乳鼠海马神经元细胞膜上的L型Ca2+通道电流增强。结果显示与正常对照组相比，3-MA使L型Ca2+通道电流增强，而rapamycin使L型Ca2+通道电流减弱，说明在正常生理情况下，通过对mTOR信号转导通路进行抑制或激动可使海马神经元L型Ca2+通道电流发生改变。同时结果还显示 gp120V3+3-MA组较gp120V3组L型Ca2+通道电流增强，gp120V3+rapamycin组较gp120V3组L型Ca2+通道电流减弱，说明海马神经元在HIV-1 gp120V3环作用的环境下，通过对mTOR信号转导通路进行抑制或激动亦使L型Ca2+通道电流发生改变。

本实验从电生理角度证明，自噬可能参与了HIV-1 gp120V3环介导的海马神经元L型钙离子通道电流的改变。为临床上对自噬进行干预，即通过改变自噬状态来保护海马神经元，从而防治HAND提供理论依据。

[参 考 文 献]

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[3] Kapur A, Yeckel MF, Gray R, et al. L-Type calcium channels are required for one form of hippocampal mossy fiber LTP[J]. J Neurophysiol, 1998, 79(4):2181-2190.

[4] Tang HM, Pan R, Fang WL, et al. Curcumin ameliorates hippocampal neuron damage induced by human immunodeficiency virus-1[J]. Neural Regen Res, 2013, 8(15):1368-1375.

[5] Shi R, Weng J, Zhao L, et al. Excessive autophagy contributes to neuron death in cerebral ischemia[J]. CNS Neurosci Ther, 2012，18(3):250-260.

[6] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12):2445-2462.

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[9] Zhou T, Xu L, Dey B, et al. Structural definition of a conserved neutralization epitope on HIV-1 gp120[J]. Nature, 2007, 445(7129)：732-737.

[10]Qin AP, Zhang HL, Qin ZH. Mechanisms of lysosomal proteases participating in cerebral ischemia-induced neuronal death[J]. Neurosci Bull, 2008, 24(2): 117-123.