着色性干皮病基因D和p53对HBV复制的影响*

丁 浩， 张吉翔

(南昌大学第二附属医院消化内科，江西 南昌 330006)

着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是转录因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的其中一个组份[1]。已有研究发现，XPD可保护宿主细胞，阻止HIV和MMLV的感染，并下调已整合病毒的表达[2]。所以我们提出假设：XPD亦能抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制。本研究组已经证实，XPD能升高p53的表达[3-4]。因此，我们亦可提出假设：XPD可能通过p53通路抑制HBV复制。为证实上述假设，本研究把重组人XPD质粒用脂质体转染进入人肝癌细胞株HepG2.2.15(整合并能复制HBV的HepG2细胞)，并使用pifithrin-α(p53抑制剂)孵育细胞，然后测定乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的mRNA水平，检测培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，同时测定细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量，探讨XPD与p53对乙型肝炎病毒复制的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

肝癌细胞株HepG2.2.15是由复旦大学附属华山医院传染科张轶俊博士惠赠；DMEM培养基购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；G418购自Solarbio；重组质粒pEGFP-N2/XPD由本实验室构建，pEGFP-N2/XPD已经通过PCR反应、酶切及基因测序鉴定[5]；RNA提取试剂Trizol和脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen；p53抑制剂pifithrin-α购自Sigma；逆转录试剂盒购自Fermentas；引物购自Generay Biotech；2×Taq PCR Master Mix购自天根生物；HBsAg和HBeAg的ELISA检测试剂盒购自广东中山生物工程有限公司； VERSANT HBV branched DNA (bDNA) 检测试剂盒购自Bayer；HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒购自广州中山大学达安基因公司。

2 方法

2.1细胞培养、质粒转染和pifithrin-α的孵育 把HepG2.2.15细胞放置于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418和双抗(100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素)的DMEM培养瓶中，在37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养。以每孔1×105细胞的密度把细胞铺于6孔板中，24 h后细胞融合率为90%。使用LipofectamineTM2000将空载质粒pEGFP-N2和重组质粒pEGFP-N2/XPD转染进入细胞，质粒4.0 μg/well，脂质体10 μL/well介导转染。转染后的第2天使用20 μmol/L pifithrin-α孵育细胞24 h。将实验分为5组：(1)空白对照组；(2) pEGFP-N2组；(3) pEGFP-N2/XPD组；(4)pEGFP-N2/XPD+ pifithrin-α组；(5)pifithrin-α组。

2.2RT-PCR RNA抽提和逆转录参照试剂盒说明书进行。XPD上游引物5’-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3’，下游引物5’-CGATTCCCTCGGACACTTT-3’，产物大小为363 bp；HBsAg上游引物5’-AACATCAACTACCAGCACG-3’，下游引物5’-CACTGAACAAATGGCACTA-3’，产物大小为210 bp；HBeAg上游引物5’-CCTGCTCAAGGCAACTCT-3’，下游引物5’-GAAAGCCCTACGAACCAC-3’, 产物大小为182 bp；HBx上游引物5’-CACTTCGCCTCACCTCTG-3’，下游引物5’-TCGGTCGTTGACATTGCT-3’, 产物大小为112 bp；β-actin上游引物5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，产物大小为434 bp。PCR反应体系配制如下：上、下游引物各1 μL，cDNA 500 ng，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，补ddH2O至25 μL终体积。以下列条件进行PCR 反应：预变性，1个循环， 94 ℃ 5 min；PCR反应，35个循环，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s；延伸，72 ℃ 7 min。取5 μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用紫外透射仪观察电泳结果并拍照。拍照结果用BANDLEAD 3.00软件进行分析，以目的条带/β-actin的吸光度比值进行对比。

2.3ELISA配洗涤液，将浓缩洗涤液用蒸馏水或ddH2O以1∶25的比例稀释。将待测样品以50μL/well加入包被板，并设阴性对照、阳性对照和空白对照各2孔(阴性、阳性对照孔分别加入相应对照血清各50μL，空白对照孔则加入100μL洗涤液)。立即加入酶标记物50μL/well(空白对照孔则不加)，混匀。覆盖封板胶，放置于37 ℃避光孵育30min。使用洗涤液洗板5次，每次均静置1min，反扣晾干。加入底物A、B液各50μL/well，37 ℃避光显色10min后，加入终止液50μL/well。使用酶标仪450nm(单波长)以空白对照孔调零，或者用450nm/630nm(双波长)，检测各孔吸光度(A)。

2.4HBV-DNA荧光定量PCR 取100 μL细胞培养上清液加入等量的DNA浓缩液，充分混匀、离心10 min。倒去上清，沉淀中加入30 μL DNA提取液，充分混匀、离心数秒，100 ℃水浴孵育10 min，离心后备用。按试剂盒说明书处理阴性质控品和阳性质控品。按比例(HBV PCR反应液40 μL/份+Taq酶3 μL/份)取相应量PCR反应液和Taq酶，充分混匀，按每管43 μL分装至0.2 mL EP管中备用。向准备好试剂的0.2 mL EP管中分别加入处理后的样品(包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2 μL，离心，随后放入样品槽中。设置荧光定量PCR仪条件：93 ℃ 2 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,10个循环;93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,30个循环。

2.5HBVbDNA实验 将6孔板中的经实验处理的细胞以PBS洗涤2次，用细胞裂解液将细胞转移至EP管内，离心后保留上清液，加DNaseI和RNaseA37 ℃ 孵育15min后，以EDTA和PEG8000沉淀核心颗粒，然后重悬沉淀，加裂解液孵育过夜，用酚-氯仿-异戊醇抽提，干燥后溶于50μL双蒸水中。应用bDNA试剂盒定量检测HBV-DNA的滴度，其最低检测值为0.7GEq/L。

3 统计学处理

实验均重复6次，使用统计学软件SPSS 13.0分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α对HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组和pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α组XPD mRNA的表达明显增多(均P<0.01)；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表达明显减少(均P<0.01)；与空白对照组相比，pifithrin-α处理组HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表达明显增多(P<0.05或P<0.01)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α组HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表达明显增多(均P<0.01)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(均P>0.05)，见图1。

Figure 1. The changes of mRNA expression levels of XPD, HBsAg, HBeAg and HBx in HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.M: 100 bp marker; A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C;△P<0.01, △△P<0.05 vs A.

2 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的影响

ELISA结果发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少(均P<0.01)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显增多(均P<0.01)；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义(均P>0.05),见图2。

Figure 2. The content of HBsAg and HBeAg in the supernatants of culture medium of HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group;D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C

3 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α对培养上清液和细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量的影响

荧光定量PCR和bDNA结果显示，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液和细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量明显减少(均P<0.01)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α组的培养上清液和细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量明显增多(均P<0.01)；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义(均P>0.05)，见图3。

讨 论

p53基因是公认的抑癌基因，当DNA受损时，p53先诱导细胞进入细胞周期的G1期，从而抑制细胞的增殖，直到受损DNA被修复。如果DNA不被修复，p53就介导受损细胞发生凋亡[6]。XPD是剪切修复基因，其蛋白有着重要的核酸剪切修复能力[7]。当DNA受损时，XPD能活化DNA的损伤检控点，能修复受损DNA，增加基因稳定性，从而避免基因突变[8]。本研究组既往的实验已经证实，XPD能上调肝癌细胞中p53的表达[3-4]。

Figure 3. The content of HBV-DNA in the supernatants of culture medium and the core particles in the HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; #P<0.01 vs C.

在我国范围内，乙型肝炎是造成慢性肝炎、肝纤维化以及肝癌的主要原因[9]。HBV大量复制诱发了宿主肝细胞针对HBV的免疫应答，而后者导致了宿主肝细胞的损害，从而造成了肝炎和肝纤维化[10]。所以，抑制HBV复制以及彻底清除宿主肝细胞内的HBV是治疗乙型肝炎的目标。但是，现在针对乙型肝炎的治疗方法均不甚理想，效果有限。

Yoder等[2]的研究结果发现，XPD的核酸剪切修复功能的丧失能使得病毒MMLV在宿主细胞内的表达升高，即XPD能下调已整合的MMLV表达。所以，我们提出假设：XPD亦能抑制HBV在宿主细胞内复制。而且如前所述， XPD能升高p53表达[3-4]。因此，我们假设：XPD可能是通过p53通路来阻断HBV复制。

为证实上述假设，本研究将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染进入肝癌细胞株HepG2.2.15，使得XPD表达增高，同时使用pifithrin-α抑制p53，然后检测HBV复制的变化。需要指出的是，本研究使用的人肝癌细胞株HepG2.2.15是整合了HBV并能复制HBV的HepG2细胞株[11]。另外，本研究使用到的pifithrin-α是一种p53抑制剂，能可逆性阻断p53依赖的基因转录激活[12-13]。

本研究发现，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD能下调HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表达，减少培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，并减少细胞内核心颗粒中HBV-DNA含量。这表明，XPD可抑制HBV复制。本研究还发现，XPD上述作用均能被pifithrin-α阻断。这表明，XPD阻断HBV复制是通过p53通路而实现的。

本研究还发现，与空白对照组相比，pifithrin-α能上调HBsAg和HBeAg mRNA的表达，然而对培养上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的含量却没有明显影响。就本研究结果来看，我们分析其可能原因是： pifithrin-α降低细胞内HBsAg和HbeAg mRNA的表达幅度原本较小，而HBsAg、HBeAg及HBV-DNA从细胞内释放进入培养上清液后浓度即被稀释，这导致了HBsAg、HBeAg及HBV-DNA在培养上清液中的含量被检测时，与空白对照相比无明显差异。

综上所述，XPD可通过p53通路抑制HBV复制。所以，XPD和p53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的分子作用靶点，为治疗乙型肝炎提供新的可能途径。

[参 考 文 献]

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