密花核果木抗肿瘤有效部位的筛选研究

惠++阳②++陈光英++宋小平++陈文豪

热带药用植物化学教育部重点实验室 海南海口 571127）

摘 要 采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法，以2种人肿瘤细胞株（SGC-7901、SPCA-1）为研究对象，对海南地区核果木属植物密花核果木的抗肿瘤有效部位进行筛选研究。采用硅胶柱色谱分离技术对石油醚、氯仿萃取部位进行进一步的分离，获得不同极性组分。抗肿瘤活性试验结果表明，石油醚、氯仿萃取部位及其不同极性组分显示不同程度的肿瘤细胞增殖抑制活性，是其抗肿瘤有效部位。

关键词 核果木属 ；密花核果木 ；抗肿瘤活性 ；SGC-7901 ；SPCA-1

分类号 R284.1

全世界大戟科（Euphorbiaceae）核果木属（Drypetes）植物约200种，主要分布在亚洲、美洲和非洲中西部等热带、亚热带地区。在非洲民间，该属植物为传统药材，主要用于治疗淋病、恶性肿瘤、黑热病、类风湿、支气管炎等症[1-2]，药用史由来已久。中国核果木属植物产13种，2变种，分布于台湾、广东、海南、广西、贵州和云南等省区[3]。近10年来，国内外学者对该属植物进行了广泛的化学成分研究，从中分离得到倍半萜内酯[4-6]、罗汉松烷型二萜[7-8]、齐墩果烷和木栓烷型三萜[9-11]、查尔酮[12]和一些多酚类化合物[13]，同时还进行了诸如抗炎镇痛、抗病原虫、抗真菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性等药理活性研究[4-6，9-11，13]，但针对该属植物进行抗肿瘤活性方面的研究还未见报道。

密花核果木（Drypetes congestiflora Chun & T. Chen）分布于海南、广东、云南等省的山地疏林中，是一新拟种，为海南主要经济林木[3]，以Drypetes congestiflora为关键词，在SciFinder数据库搜索发现，目前未见国内外对其化学成分和药理活性的相关研究报道。课题组前期研究发现，其乙醇提取物对人肺癌细胞（SPCA-1）、人胃癌细胞（SGC-7901）及人白血病细胞（K-562）具有较强的肿瘤细胞毒活性。笔者对密花核果木的乙醇提取物的不同溶剂萃取物进行进一步抗肿瘤活性筛选，以期为跟踪分离具有较好抗肿瘤活性的单体化合物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

密花核果木的茎于2011年7月采自海南省昌江市。经海南师范大学生命科学学院钟琼芯教授鉴定为大戟科（Euphorbiaceae）核果木属（Drypetes）密花核果木（Drypetes congestilora Chun & T. Chen）。

1.1.2 仪器与试剂

高压灭菌锅（森展企业有限公司）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；Elx800型酶标仪（美国BioTek公司）；MCO-15AC型CO2恒温培养箱（SANYO公司）；超净工作台（苏州净化设备厂）。RPMI-1640培养液（Gibco公司）；胰酶（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；优级新生牛血清（兰州民海生物工程有限公司）；硅胶柱层析填料（青岛海洋化工厂分厂，200-300目）。石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（西陇化工股份有限公司）。

1.1.3 细胞株

人肺腺癌细胞株SPCA-1（南方医科大学）；人胃癌细胞株SGC-7901（中国热带农业科学院）。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

采密花核果木茎20 kg用95%乙醇室温浸泡3次，5 d/次，合并提取液，减压浓缩得粘稠状棕色浸膏1.0 kg，将其加水悬浮分散，分别用石油醚（60～90℃），氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得相应萃取部位：石油醚（80 g），氯仿（120 g），乙酸乙酯（15 g）和正丁醇（450 g）。

称取石油醚部位75 g，采用80 g（200～300目，下同）柱层析硅胶拌样，800 g硅胶湿法装柱，采用石油醚～乙酸乙酯（30∶1～3∶2）梯度洗脱，TLC检测合并相同流份，减压浓缩得A1 （石油醚∶乙酸乙酯=30∶1），A2（20∶1），A3（15∶1），A4（10：1），A5（8∶1），A6（5∶1），A7（3∶1）， A8（2∶1），A9（3∶2）；氯仿萃取部位（115 g）加硅胶（110 g）拌样，挥干。硅胶1.0 kg湿法装柱，氯仿～乙酸乙酯（25∶1～0∶1）梯度洗脱。TLC检测合并相同流份，减压浓缩得B1 （氯仿∶乙酸乙酯=25∶1），B2 （15∶1），B3 （9∶1），B4（6∶1），B5（4∶1），B6 （3∶1），B7（2∶1），B8（0∶1）。以上4种不同溶剂萃取部位和石油醚、氯仿萃取部位各个极性组分均用于抗肿瘤活性筛选。

1.2.2 体外肿瘤细胞增殖抑制活性实验

肿瘤细胞株培养：用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞增殖抑制试验（MTT法[14]）：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个/mL 的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180 μL。在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养8～10 h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为1、10和100 μg/mL。每个浓度平行3孔，继续培养44 h后，每孔加入50 μL MTT （1 mg/mL，PBS配制），在37℃、5% CO2条件下继续温育4 h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15 min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570 nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组（仅加入含细胞的培养液）和对照组（以培养液替代药物），计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=（1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值）×100%。endprint

IC50值的测定：根据MTT实验初步筛选结果，选择浓度为100 μg/mL时抑制率>50%的样品，进一步测定其半数抑制浓度IC50。以同一样品浓度对数值为横坐标，以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS 13.0进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂萃取部位对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行抗肿瘤试验。若样品浓度为100 μg/mL时，对肿瘤细胞增殖抑制率>50%再进行IC50值测定。结果如表1所示，石油醚部位对所选肿瘤细胞株SPCA-1、SGC-7901均显示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分别为100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位对SGC-7901细胞显示微弱抑制增殖活性，IC50值为130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同极性组分对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同极性组在浓度为100 μg/mL时，对SPCA-1、SGC-7901肿瘤细胞增殖抑制率试验。结果如表2所示，石油醚萃取部位的不同极性组分表现出较为广泛的增殖抑制活性，抑制率从30.67%～85.61%，且A6-A9这5个组分均具有相当的肿瘤细胞毒活性。进一步TLC检测发现，在254 nm紫外灯照射下均无明显斑点，而采用硫酸乙醇（5% V/V）显色剂显色发现，它们主要为三萜或者是甾醇类的特征紫色或紫红色斑点；而氯仿萃取部位的不同极性组分也表现出较萃取部位更好的抗肿瘤活性，其中B1、B5-B7的活性较好，抑制率从56.78%～74.69%。TLC检测发现其与石油醚部位的成分存在明显差异，特别是254 nm紫外灯照射下显示有明显斑点，综合文献所述，核果木属植物化合物的结构特点可能存在罗汉松烷型二萜或倍半萜内酯等具有共轭体系的化合物，这对于后期活性成分分离需要重点关注。

3 讨论

核果木属植物作为非洲民间治疗恶性肿瘤的传统药材，但目前国内外针对该属植物主要侧重于抗炎镇痛、抗病原虫、抗真菌等活性研究，尚未开展抗肿瘤活性方面的研究工作。密花核果木作为海南地区主要经济林木，资源丰富，但目前尚未见有关其化学成分及药理活性的报道。本实验结果发现，密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同极性组分显示出广泛的肿瘤细胞增殖抑制活性。为密花核果木植物资源的综合利用及抗肿瘤药开发提供理论依据。

参考文献

[1] Dalziel M J. The useful plants of west tropical africal[M]. London： The Crown Agents for the Colonies 1937， 140-141.

[2] Irvine F R. Woody plants of Ghana [M]. London： Oxford University Press， 1961， 223-226.

[3] 中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京：科学出版社，1994， 44：39-51.

[4] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic properties of the stem extract of Drypetes molunduana Pax and Hoffm. （Euphorbiaceae）in rats[J]. Pharmaceutical and Pharmacological Letters， 2001， 11（2）： 61-63.

[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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IC50值的测定：根据MTT实验初步筛选结果，选择浓度为100 μg/mL时抑制率>50%的样品，进一步测定其半数抑制浓度IC50。以同一样品浓度对数值为横坐标，以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS 13.0进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂萃取部位对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行抗肿瘤试验。若样品浓度为100 μg/mL时，对肿瘤细胞增殖抑制率>50%再进行IC50值测定。结果如表1所示，石油醚部位对所选肿瘤细胞株SPCA-1、SGC-7901均显示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分别为100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位对SGC-7901细胞显示微弱抑制增殖活性，IC50值为130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同极性组分对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同极性组在浓度为100 μg/mL时，对SPCA-1、SGC-7901肿瘤细胞增殖抑制率试验。结果如表2所示，石油醚萃取部位的不同极性组分表现出较为广泛的增殖抑制活性，抑制率从30.67%～85.61%，且A6-A9这5个组分均具有相当的肿瘤细胞毒活性。进一步TLC检测发现，在254 nm紫外灯照射下均无明显斑点，而采用硫酸乙醇（5% V/V）显色剂显色发现，它们主要为三萜或者是甾醇类的特征紫色或紫红色斑点；而氯仿萃取部位的不同极性组分也表现出较萃取部位更好的抗肿瘤活性，其中B1、B5-B7的活性较好，抑制率从56.78%～74.69%。TLC检测发现其与石油醚部位的成分存在明显差异，特别是254 nm紫外灯照射下显示有明显斑点，综合文献所述，核果木属植物化合物的结构特点可能存在罗汉松烷型二萜或倍半萜内酯等具有共轭体系的化合物，这对于后期活性成分分离需要重点关注。

3 讨论

核果木属植物作为非洲民间治疗恶性肿瘤的传统药材，但目前国内外针对该属植物主要侧重于抗炎镇痛、抗病原虫、抗真菌等活性研究，尚未开展抗肿瘤活性方面的研究工作。密花核果木作为海南地区主要经济林木，资源丰富，但目前尚未见有关其化学成分及药理活性的报道。本实验结果发现，密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同极性组分显示出广泛的肿瘤细胞增殖抑制活性。为密花核果木植物资源的综合利用及抗肿瘤药开发提供理论依据。

参考文献

[1] Dalziel M J. The useful plants of west tropical africal[M]. London： The Crown Agents for the Colonies 1937， 140-141.

[2] Irvine F R. Woody plants of Ghana [M]. London： Oxford University Press， 1961， 223-226.

[3] 中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京：科学出版社，1994， 44：39-51.

[4] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic properties of the stem extract of Drypetes molunduana Pax and Hoffm. （Euphorbiaceae）in rats[J]. Pharmaceutical and Pharmacological Letters， 2001， 11（2）： 61-63.

[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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IC50值的测定：根据MTT实验初步筛选结果，选择浓度为100 μg/mL时抑制率>50%的样品，进一步测定其半数抑制浓度IC50。以同一样品浓度对数值为横坐标，以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS 13.0进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂萃取部位对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行抗肿瘤试验。若样品浓度为100 μg/mL时，对肿瘤细胞增殖抑制率>50%再进行IC50值测定。结果如表1所示，石油醚部位对所选肿瘤细胞株SPCA-1、SGC-7901均显示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分别为100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位对SGC-7901细胞显示微弱抑制增殖活性，IC50值为130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同极性组分对肿瘤细胞增殖抑制作用

采用MTT法对密花核果木茎乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同极性组在浓度为100 μg/mL时，对SPCA-1、SGC-7901肿瘤细胞增殖抑制率试验。结果如表2所示，石油醚萃取部位的不同极性组分表现出较为广泛的增殖抑制活性，抑制率从30.67%～85.61%，且A6-A9这5个组分均具有相当的肿瘤细胞毒活性。进一步TLC检测发现，在254 nm紫外灯照射下均无明显斑点，而采用硫酸乙醇（5% V/V）显色剂显色发现，它们主要为三萜或者是甾醇类的特征紫色或紫红色斑点；而氯仿萃取部位的不同极性组分也表现出较萃取部位更好的抗肿瘤活性，其中B1、B5-B7的活性较好，抑制率从56.78%～74.69%。TLC检测发现其与石油醚部位的成分存在明显差异，特别是254 nm紫外灯照射下显示有明显斑点，综合文献所述，核果木属植物化合物的结构特点可能存在罗汉松烷型二萜或倍半萜内酯等具有共轭体系的化合物，这对于后期活性成分分离需要重点关注。

3 讨论

核果木属植物作为非洲民间治疗恶性肿瘤的传统药材，但目前国内外针对该属植物主要侧重于抗炎镇痛、抗病原虫、抗真菌等活性研究，尚未开展抗肿瘤活性方面的研究工作。密花核果木作为海南地区主要经济林木，资源丰富，但目前尚未见有关其化学成分及药理活性的报道。本实验结果发现，密花核果木茎乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同极性组分显示出广泛的肿瘤细胞增殖抑制活性。为密花核果木植物资源的综合利用及抗肿瘤药开发提供理论依据。

参考文献

[1] Dalziel M J. The useful plants of west tropical africal[M]. London： The Crown Agents for the Colonies 1937， 140-141.

[2] Irvine F R. Woody plants of Ghana [M]. London： Oxford University Press， 1961， 223-226.

[3] 中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志[M]，北京：科学出版社，1994， 44：39-51.

[4] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic properties of the stem extract of Drypetes molunduana Pax and Hoffm. （Euphorbiaceae）in rats[J]. Pharmaceutical and Pharmacological Letters， 2001， 11（2）： 61-63.

[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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